《生物化學(xué)》本科課件14章 核酸分子雜交

1、DNA的均一性：病毒DNA均一DNA, Tm值范圍窄。 動物細(xì)胞DNA不均一DNA, Tm值范圍較寬。核酸分子雜交(Hybridization of nucleic acids ) 核酸分子雜交的雙方是待測核酸序列及探針。待測的核酸可以是克隆基因片段、基因組DNA、細(xì)胞總RNA。將核酸從細(xì)胞中分離純化后可以在體外與探針雜交（膜上印跡雜交），也可以直接在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行（原位雜交）。 探針（probe）：是一種已知的、僅與特異性靶分子反應(yīng)的分子。 探針必須用一定的手段加以標(biāo)記，以利于以后的檢測。常用的標(biāo)記物包括放射性核素和非放射性標(biāo)記物兩大類。檢測這些標(biāo)記物的方法都是極其靈敏的。 核酸分子探針核酸-分

2、子雜交 雜交的雙方是 待測核酸 及 探針 兩條互補(bǔ) DNA 單鏈 或一條 DNA 單鏈與互補(bǔ)的RNA 鏈形成雙鏈核酸分子的過程稱為核酸分子雜交。通常是探針與受體 DNA 或 RNA 分子的之間的雜交。 探針 (probe) 用同位素或非同位素標(biāo)記的具有已知核苷酸順序的單鏈 DNA 或 RNA 分子稱為探針。探針用于鑒別或分離基因以及檢測基因的表達(dá)。DNA探針、RNA探針、cDNA探針及寡核苷酸探針探針的種類：基因組DNA探針、cDNA探針、cRNA探針、 寡核苷酸探針（1）雙鏈DNA探針。通過切口平移標(biāo)記或隨機(jī)引物標(biāo)記法標(biāo)記。后者能產(chǎn)生高比活的探針，但標(biāo)記探針的產(chǎn)量較低，不適量切片的原位雜交。

3、 （2）人工合成脫氧寡核苷酸。由DNA合成儀合成，與克 隆的DNA相比，人工合成脫氧寡核苷酸有下列優(yōu)點：特 異性較高，當(dāng)DNA順序未知時可按氨基酸順序進(jìn)行合 成，可用于相似基因順序差異研究；可用合成的不同順 序探針對特定基因進(jìn)行最佳雜交條件的篩選；由于分子 量小，與相同量的dsDNA探針相對而言，具有高得多的 摩爾濃度。 （3）單鏈cDNA探針。單鏈cDNA探針常通過克隆載體M13 獲得。ssDNA探針與dsDNA探針相對比，其最大優(yōu)點 在于，ssDNA探針不會像dsDNA探針那樣與自身互補(bǔ) 的第二條鏈復(fù)性雜交，增加了探針的有效濃度。 （4）反義寡核苷酸探針。見合成的20-70個寡核苷酸克隆

4、到RNA表達(dá)載體上而獲得。這種探針既有寡核苷酸 探針的優(yōu)點，又有cDNA探針的優(yōu)點。 （5）單鏈反義RNA探針。可由構(gòu)建的RNA表達(dá)載體而獲得。 在RNA聚合酶的作用下，以DNA為模板合成反義RNA 探針。這種探針與切口平移標(biāo)記的DNA探針相比，特異 性高，RNA/RNA形成的雜交分子具有熱穩(wěn)定性，而且 探針的大小也比較恒定，因而增加了雜交的敏感性及均 一性。此反義RNA探針不含有載體順序，減少了非特異 性雜交，還能防止dsDNA中第二條鏈的競爭性雜交。雜 交后用RNA酶消化單鏈未雜交的探針，可明顯減少本底。 因此，RNA探針在核酸原位雜交中的應(yīng)用也越來越廣泛。 示cDNA轉(zhuǎn)錄為cRNA，可標(biāo)

5、記以不同的標(biāo)記物，然后與細(xì)胞中的mRNA相結(jié)合。Biotin(生物素)，Au(金)，digo-（地高辛)/ebook/study/nuclear/16922.html cRNA探針在原位雜交組織化學(xué) 核酸雜交技術(shù)探針技術(shù) 利用標(biāo)記分子對其它分子的識別 對后者進(jìn)行檢測探針帶有供反應(yīng)后檢測的合適標(biāo)記物，并與特異靶分子反應(yīng)。 探 針 靶分子反應(yīng) 抗 體 抗原 外源凝集素 碳水化合物、 親合素 生物素、 受 體 配基（Ligand） 互補(bǔ)核酸間 標(biāo)記方法 放射性探針 非放射性探針(一) 核酸分子雜交原理1DNA 變性 DNA 分子在一定條件下其雙鏈之間的氫鍵斷裂而形成單鏈分子現(xiàn)象稱為 DNA 變性。熱

6、變性：90-100C溶解溫度 (melting temperature，Tm) 為雙鏈 DNA 變性一半所需的溫度。 堿變性：pH 10化學(xué)試劑變性：尿素、甲酰胺、甲醛2DNA 分子的復(fù)性 變性的 DNA 分子的兩條互補(bǔ)單鏈在一定的條件下重新組合成雙鏈螺旋結(jié)構(gòu)，稱為 DNA 復(fù)性或退火。Absorbance at 260 nm濃度 = 50 g/ml雙鏈 DNA A260 = 1.00 單鏈 DNA A260 = 1.37堿基 A260 = 1.60變性 DNA 的粘度降低、A260 紫外吸收值增加。(二) 探針的標(biāo)記1. 同位素標(biāo)記探針 常用的同位素為 32P、35S2. 非同位素標(biāo)記探針

7、非同位素標(biāo)記探針不危害操作者的健康并且不污染環(huán)境； 非同位素標(biāo)記探針比較穩(wěn)定 (可儲存一年以上) 并且可反 復(fù)使用多次； 多種檢測方法 (顯色反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光或熒光檢測) 均能檢 測出非同位素標(biāo)記探針; 與同位素標(biāo)記的探針有相同的敏感性。 常用的非同位素標(biāo)記分的高辛 (Digoxigenin，DIG) 生物素 (Biotin) 3DIG 標(biāo)記探針的方法(三) 膜支持物1硝酸纖維素膜 (Nitrocellulose membrane) DNA 非共價結(jié)合到膜上。 硝酸纖維素膜的強(qiáng)度低、易碎。2尼龍膜 (Nylon membrane) DNA 共價結(jié)合到帶正電荷的尼龍膜上；尼龍膜有較強(qiáng)的結(jié)合 DNA

8、 的能力并能與 50 bp 的核苷酸鏈結(jié)合。 尼龍膜的強(qiáng)度高，利于探針的去除和重新雜交。(四) 受體分子從凝膠向膜的轉(zhuǎn)移1. 毛細(xì)管轉(zhuǎn)移 (Capillary transfer) 2. 電轉(zhuǎn)移 (Electroblotting) 3. 真空或正壓轉(zhuǎn)移 (Vacuum or positive pressure blotting) 印漬技術(shù) Blotting 首先由Edwen Southern在1975年提出。Blotting即“印漬”，指將存在于凝膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移（印漬）到固定化介質(zhì)上，并加以檢測分析的技術(shù)，目前廣泛應(yīng)用于DNA、RNA、和蛋白質(zhì)的檢測 印漬技術(shù)的類別及應(yīng)用 DNA印跡技術(shù)

9、Southern blottingRNA印跡技術(shù) Northern blotting蛋白質(zhì)印跡技術(shù) Western blotting 斑點印跡 Dot blotting原位雜交 in situ hybridization DNA點陣 DNA array DNA芯片技術(shù) DNA chip 重 物轉(zhuǎn)移緩沖液濾紙橋玻璃板硝酸纖維素膜或尼龍膜含變性 DNA的瓊脂糖凝膠濾紙玻璃板紙 巾毛細(xì)管轉(zhuǎn)移濾紙(五) 將受體分子固定在膜上的方法1. 干烤 置硝酸纖維素膜于抽真空的 80C 烤箱中 2 小時； 置尼龍膜于抽真空的 120C 烤箱中 2 小時。2. UV 交聯(lián)作用 用 UV 將 DNA 固定在硝酸纖維素

10、膜或尼龍膜上。UV 交聯(lián)儀(六) DIG 探針與受體分子的雜交靶分子 (DNA 或 RNA 分子)硝酸纖維素膜或尼龍膜DIG 標(biāo)記的探針與靶分子雜交DIG 標(biāo)記的探針DIG-dUMP(六) DIG 探針與受體分子的雜交(七) DIG 信號檢測1. 在抗 DIG 抗體上偶聯(lián)熒光素 用于原位雜交2. 在抗 DIG 抗體上偶聯(lián)堿性磷酸酶，以堿性磷酸酶催 化的底物顯色反應(yīng)或化學(xué)發(fā)光反應(yīng)檢測 DIG 探針的 雜交信號。(1) 用于顯色反應(yīng)的底物 NBT (氮藍(lán)四唑鹽酸鹽) BCIP (5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽) (2) 用于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的底物 AMPPD、CSPD 和 CDP-Star用熒光素檢測

11、雜交信號抗 DIG 抗體熒光素細(xì)胞核染色體抗 DIG 抗體用堿性磷酸酶檢測雜交信號堿性磷酸酶顯色反應(yīng)底物 NBT (氮藍(lán)四唑鹽酸鹽) BCIP (5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽) 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)底物 AMPPD、CSPD 和 CDP-Star核酸原位雜交的主要過程 經(jīng)過五大過程：固定，預(yù)雜交、雜交、沖洗和顯示。 一組織細(xì)胞的固定 進(jìn)行核酸原位雜交的組織或細(xì)胞必須經(jīng)過固定處理。 固定液：1.能很好地保護(hù)組織細(xì)胞的形態(tài)。 2.對核酸無抽提、修飾與降解作用。 3.不改變核酸在細(xì)胞內(nèi)的定位。 4.對核酸與探針的雜交過程無阻礙作用。 5.對雜交信號無遮蔽作用。 6.理化性質(zhì)穩(wěn)定、價格低廉。 4%多聚甲醛：

12、能很好地保持組織或細(xì)胞內(nèi)的RNA，一般固定10-15分鐘RNA的含量比較恒定。 10%的甲醛液：雖然可促進(jìn)DNA雙鏈分子的交聯(lián)進(jìn)而變性，但用含50%的甲酰胺雜交液進(jìn)行雜交可解決。 乙醇/冰醋酸（3/1）:雖然廣泛用于核酸原位雜交時的組織細(xì)胞固定，不過固定后組織細(xì)胞內(nèi)RNA明顯減少，但同時本底也很低。二預(yù)雜交 目的：是去除核酸表面的蛋白質(zhì)，以利于核酸探針對靶核 酸進(jìn)行雜交。 組織細(xì)胞中的核酸都以核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體的形式存在與細(xì)胞漿或細(xì)胞核中，固定過程中固定液的交聯(lián)作用時胞漿或胞核內(nèi)的各種生物大分子形成網(wǎng)絡(luò)，影響探針的穿透力，阻礙雜交體的形成。 常用的去垢劑：Triton-X100 十二烷基碘酸鈉（

13、SDS） 常用的蛋白酶：蛋白酶K。三、雜交 雜交過程是核酸原位雜交技術(shù)的主要環(huán)節(jié)。1、探針的選擇核酸原位雜交中所用的探針可以是雙鏈的DNA（dsDNA）也可以是單鏈的DNA（ssDNA）,或為RNA。近年來人工合成的寡核苷酸也得到了廣泛應(yīng)用。一般而言，標(biāo)記的DNA或RNA探針都可用于DNA或RNA的定位，其長度為50-300bp（堿基）最好，這個長度范圍的探針在組織細(xì)胞中的穿透力好，雜交效率高。四、沖洗 雜交后沖洗是減低非特異性雜交的關(guān)鍵步驟，其SSC的濃度可低至0.1SSC。 應(yīng)用放射性核素探針時，沖洗可達(dá)幾小時，而用生物素及地高辛等標(biāo)記的探針沖洗時間則可縮短為15分鐘。 沖洗時溫度不能高于

14、50，否則將導(dǎo)致組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞及組織或細(xì)胞從切片上脫落，使實驗失敗。 五、顯示 核酸原位雜交結(jié)果的顯示應(yīng)體現(xiàn)特異性和敏感性。當(dāng)DNA探針長度超過0.5Kb時非特異性雜交增多，本底增高。 探針與無關(guān)基因中部分同源順序的非特異性結(jié)合亦是非特異性雜交的原因之一。 除探針的非特異性結(jié)合外，檢測系統(tǒng)亦是導(dǎo)致非特異性結(jié)果的原因之一。 生物素標(biāo)記的探針，常用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測，在許多組織中因含有內(nèi)源性生物素（維生素H）而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。地高辛標(biāo)記就不存在這種問題。 *對照試驗核酸分子雜交方法及特點（一）DNA印跡技術(shù) Southern blotting 又稱為Southern雜交，即DNA-DNA雜交

15、分析。研究DNA圖譜的基本技術(shù)用于基因組DNA分析，如在基因組中特異基因定位及檢測用于分析重組質(zhì)粒和噬菌體。遺傳診斷DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析基本方法DNA標(biāo)本用限制性內(nèi)切酶消化，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段；經(jīng)堿變性，Tris緩沖液中和，高鹽下通過毛吸作用將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素濾膜上，烘干固定，凝膠中DNA片段相對位置在DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜的過程中繼續(xù)保持著。附著在濾膜上的DNA與32P標(biāo)記的探針雜交，利用放射自顯影術(shù)確定探針互補(bǔ)的每條DNA帶的位置，確定在眾多酶解產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。Paper TowelsSouthern Blottingtiss

16、ueSDS蛋白酶K酚/氯仿無水乙醇離心斑點印跡Dot blotting斑點雜交法是不經(jīng)過電泳，而將被檢標(biāo)本直接點到膜上，烘烤固定，用于雜交。這種方法耗時短，可做半定量分析，一張膜上可同時檢測多個樣品。 原位雜交* 細(xì)胞或染色體的原位雜交，用于基因定位。 * 細(xì)菌菌落的原位雜交：篩選陽性克隆。Tissue in situ hybridization 原位雜交即組織原位雜交，指組織切片或細(xì)胞涂片直接用于雜交分析。先經(jīng)適當(dāng)處理，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交。原位雜交可以確定探針的互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置，具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。 原位雜交還是顯示細(xì)胞亞群分布和動向及病

17、原微生物存在方式和部位的一種重要技術(shù)。 用于原位雜交的探針可以是單鏈或雙鏈DNA，也可是RNA探針。 探針的標(biāo)記物可以是放射性同位素、放射性生物素和半抗原等，放射性同位素中，3H和35S最為常用，而32P能量過高，致使產(chǎn)生的影像模糊，不利于確定雜交位點。 原位雜交中，標(biāo)本的固定條件是影響雜交效率的重要因素。標(biāo)本組織蛋白質(zhì)的消化程度對探針進(jìn)入細(xì)胞極為重要，去除蛋白質(zhì)的方法是，用0.2mol/l HCl處理載玻片，用蛋白酶K消化，然后用不同濃度的乙醇脫水。原位雜交還是一種新技術(shù)，發(fā)展很快，在敏感性、特異性、穩(wěn)定性上還需進(jìn)一步完善和提高。 原位雜交Northern blotBMP-4轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞

18、mRNA斑點雜交 雙標(biāo)記陽性者同一細(xì)胞中 原位雜交信號呈紫藍(lán)色，位于細(xì)胞核中； 免疫組化陽性呈棕色，位于細(xì)胞膜或漿上/med/data/jcyx/blswx/201003/344927.html淋巴瘤的原位雜交和免疫組化雙標(biāo)記技術(shù) 基因的定量分析（二）RNA印漬技術(shù) Northern blotting又稱為Northern雜交，即RNA-DNA雜交分析。是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。主要用于檢測某一組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA的存在及表達(dá)水平以及比較不同組織和細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。RNA定量分析一個基因的表達(dá)，需要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄（mRNA生成）、翻譯（蛋白質(zhì)合成）、修

19、飾等過程，最后才能形成具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)分子。因此對一個基因的檢測，可從其表達(dá)過程中的不同階段來進(jìn)行。mRNA檢測是研究基因表達(dá)功能重要常用方法包括 Northern blot、 Slot blot、RT-PCR核糖核酸酶保護(hù)分析（ribonuclease protection assay，RPA）。mRNA定量的意義 特定基因表達(dá)水平可反映細(xì)胞的生長、存活狀態(tài),對特定基因轉(zhuǎn)錄水平的定量分析已成為基因功能研究的核心部分. mRNA定量分析用于臨床診斷，包括檢測腫瘤細(xì)胞耐藥基因的調(diào)節(jié)與表達(dá)、化療療效的分析、基因治療的生物動力學(xué)與轉(zhuǎn)錄、表達(dá)水平的研究;并提供了評價腫瘤進(jìn)展,檢測外周血中腫瘤細(xì)胞

20、的有效手段，還可用于病菌、病毒的檢測 Northern blotNorthern雜交是研究基因表達(dá)的最嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆椒ㄖ唬?可以定量分析組織中某一特異mRNA的表達(dá)豐度，根據(jù)其遷移的位置也可判斷基因分子大小。 這一技術(shù)應(yīng)用十分廣泛，常用于基因表達(dá)調(diào)控、基因結(jié)構(gòu)及功能、遺傳變異及病理研究 RT-PCR半定量分析基因表達(dá)mRNAcDNAPCR（內(nèi)參基因）RNA酶保護(hù)性實驗（Ribonuclease protection assay，RPA）mRNA定量分析方法將標(biāo)記的特異RNA探針與待測的RNA樣品液相雜交，標(biāo)記的特異RNA探針按堿基互補(bǔ)的原則與目的基因特異性結(jié)合，形成雙鏈RNA，免受RNA酶的消化；

21、未結(jié)合的單鏈RNA經(jīng)RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，故該方法命名為RNA酶保護(hù)實驗。對于32P標(biāo)記的探針，雜交雙鏈進(jìn)行變性聚丙酰胺凝膠電泳，用放射自顯影系統(tǒng)檢測被保護(hù)的探針的信號；對于生物素標(biāo)記的探針，雜交雙鏈經(jīng)過變性聚丙酰胺凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至尼龍膜，采用鏈霉親和素辣根過氧化物酶（Streptavidin-HRP）和化學(xué)發(fā)光底物與膜上biotin標(biāo)記的探針結(jié)合，X射線膠片或化學(xué)發(fā)光圖像分析儀檢測雜交信號。RPA可用于檢測在總RNA混合物中特定mRNA分子的表達(dá)。盡管操作比較復(fù)雜，但是這種方法可以在一次檢測中分析多達(dá)25樣品。敏感性和高通量的優(yōu)點使得RPA在病原體的發(fā)現(xiàn)中顯得非常有用

22、。由RPA得到的結(jié)果，結(jié)合普通的形態(tài)學(xué)技術(shù)有助于闡明疾病的發(fā)生過程。DNA微陣列技術(shù)芯片將成千上萬種基因的DNA片段有組織的點在固相片基上，將這種芯片作為探針，去檢測不同組織和不同細(xì)胞的基因表達(dá)情況。應(yīng) 用DNA微陣列技術(shù)的應(yīng)用包括:基因表達(dá)分析、多基因突變和多態(tài)性檢測、疾病診斷和分型、研究疾病分子機(jī)制藥物篩選和疫苗開發(fā) Western雜交(蛋白質(zhì)印跡)* 蛋白質(zhì)水平上的雜交技術(shù)，又稱為免疫印跡，即檢測蛋白質(zhì)與標(biāo)記的特定蛋白抗體結(jié)合，經(jīng)放射自顯影顯示條帶，根據(jù)條帶密度確定蛋白質(zhì)表達(dá)量。* 與DNA、RNA水平上的Southern雜交、Northern雜交相對應(yīng)，稱為Western雜交。* 常結(jié)

23、合Northern印跡技術(shù)，檢測基因表達(dá)調(diào)控。Western blotting用于檢測樣品中特異性蛋白質(zhì)的存在、細(xì)胞中特異蛋白質(zhì)的半定量分析以及蛋白質(zhì)分子的相互作用研究等。 檢測一個基因的表達(dá)產(chǎn)物是否正確，或者比較表達(dá)產(chǎn)物量的 相對變化，首選方法是 Western blot Western blot SDSWestern blot三種印跡技術(shù)的比較免疫組化操作規(guī)程 1、脫蠟和水化 脫蠟前，應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60恒溫箱中烘烤20分鐘。 1）組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘，2次 2）無水乙醇中浸泡5分鐘； 3）95%乙醇中浸泡5分鐘； 4）70%乙醇中浸泡5分鐘； 2、抗原修復(fù) 用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片。 1）抗原熱修復(fù) （1）高壓熱修復(fù) ：在沸水中加入EDTA或枸櫞酸鈉緩沖溶液。玻片在緩沖液中浸泡5分鐘，加壓10分鐘，（適用于較難檢測或核抗原的抗原修復(fù)）。（2）煮沸熱修復(fù) 水浴鍋加熱枸櫞酸鈉緩沖溶液至95左右，放入組織芯片加熱1015分鐘。（3）微波熱修復(fù) 適用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glyco