I型膠原-殼聚糖復合材料生物相容性研究教程文件

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。I型膠原-殼聚糖復合材料生物相容性研究-=1*ROMANI型膠原-殼聚糖復合材料的生物相容性研究基金項目：國家自然基金項目(30973048)；科技部國際合作重點項目（2008GR0403）；國家人力資源與社會保障部2009年度留學回國人員科技活動擇優(yōu)資助項目作者簡介：張永強（1985-），男，在讀碩士研究生，研究方向為關節(jié)軟骨的損傷與修復通訊作者：楊自權（1972-），男，副主任醫(yī)師，碩士研究生導師，e-mail:衛(wèi)小春（1951-），男，主任醫(yī)師，博士研究生導師，碩士研究生導師,e-mail:wei

2、xiaochun06張永強1任志鵬1楊自權1孫曉丹2衛(wèi)小春11山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院骨科骨與軟組織損傷修復山西省重點實驗室0300012清華大學材料工程學院【摘要】目的評價=1*ROMANI型膠原-殼聚糖復合材料作為組織工程支架材料的生物相容性。方法體外培養(yǎng)兔骨髓間充質干細胞（BMSCs），采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法檢測不同分組的BMSCs生長情況，酶標儀測吸光度值（OD），計算細胞相對增值率（RGR）；利用材料浸提液與兔新鮮血混合觀察紅細胞溶解情況，評價材料細胞生物相容性。結果空白組（A組），50濃度組（B組）和100濃度組（C組）BMSCs均生長良好，并于1、3、5天逐漸增殖，陽性對

3、照組（D組）細胞于第天開始變圓、皺縮，3天和5天均皺縮死亡。A、B、C三組細胞在第1、3、5天各組吸光度值無顯著差異（P0.05），但均與組有明顯統(tǒng)計學差異（P0.05),butallhadsignificantstatisticaldifferenceswithgroupD(P0.05).Hemolysispercentageofthescaffordwas4.1%.ConclusionIcollagen-chitosanscaffordhasnosignificantcytotoxicity,andaccordswiththebiomaterialstandardsoftissueengi

4、neering.KeywordsIcollagen-chitosanscafford;Testofhemolysis；Testforcytotoxicity殼聚糖是一種天然高分子生物材料，為線性多糖，是氨基多糖(GAG)的異構物。在自然界中廣泛存在,是一種來源廣泛、容易獲得并具有良好生物相容性的可降解生物材料。I型膠原是很多組織的細胞外基質成分，并已應用于很多組織工程的支架材料中，但由于單獨應用具有降解速率快、物理性能差等不足，因此常常與其他材料復合，以避免一些不足。本實驗研究的=1*ROMANI型膠原-殼聚糖復合材料是一種將=1*ROMANI型膠原和殼聚糖有機結合的新型組織工程復合載體支架材

5、料。細胞毒性實驗是一類在離體狀態(tài)下模擬生物體生長環(huán)境，檢測材料和器械接觸機體組織后生物學反應的體外試驗，它是對材料進行生物學評價的重要檢測指標之一。本實驗通過四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法檢測材料浸提液對骨髓間充質干細胞（BMSCs）生長的影響，同時進行材料浸提液的溶血試驗檢測，評價新型載體材料=1*ROMANI型膠原-殼聚糖復合材料作為組織工程支架材料的生物相容性。材料與方法1主要試驗材料、試劑和儀器=1*ROMANI型膠原-殼聚糖復合材料（清華大學提供）；2月齡新西蘭大白兔（山西畜牧研究所）；胰酶（Sigma公司）；DMEM-F12（賽默飛世爾生物化學有限公司）；胎牛血清（杭州四季青）；四

6、甲基偶氮唑鹽（Sigma公司）；苯酚（天津市福晨化學試劑廠）；BB5060型CO2培養(yǎng)箱（Heraeus公司）；MK3型酶標儀（熱電上海儀器有限公司）。2細胞毒性試驗2.1BMSCs的培養(yǎng)取2月齡新西蘭大白兔，稱重為3kg。耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（1ml/kg體重）約3ml麻妥，無菌條件下于雙側股骨大轉子處穿刺，分別自兩側骨髓腔中抽取骨髓至含有2ml肝素（3000U/ml）注射器內(nèi)，置于離心管中沖洗離心后，各加含10%胎牛血清DMEM-F12培養(yǎng)基5ml，分裝于2個25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，置入37，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3d后首次換液，以后每2-3d換液一次。待細胞長滿瓶底達80-

7、90%（圖），進行傳代，傳至三代（圖2）備用。浸提液的制備1（ISO10993-5）根據(jù)GB/T16886.522003/ISO10993-5:1999醫(yī)療器械生物學評價第5部分:體外細胞毒性試驗中的浸提液試驗，將材料按1cm試樣表面積加10ml浸提介質比例在37恒溫箱中浸提24h。浸提介質為含10%小牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液。2.3實驗分組及檢測空白組(A組)：含10%小牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液50%濃度組（B組）：材料浸提液濃度為50%100%濃度組（C組）：材料浸提液濃度為100%陽性對照組（D組）：0.64%苯酚取第三代BMSCs，配制成1105/ml細胞懸液，取3塊96孔

8、培養(yǎng)板，每板4組，每組10孔，每孔加100ul細胞懸液，置于條件同前的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24小時后，棄去原培養(yǎng)液，用PBS液洗滌2次后，分別按實驗分組進行換液，再把培養(yǎng)板放入原培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，分別于1、3、5天各取出一塊培養(yǎng)板，在倒置相差顯微鏡下觀察活細胞形態(tài)、攝影，然后加入20ul孔MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)6小時，吸除原液，再加入150ul孔二甲基亞砜（DMSO），震蕩10分鐘，在酶聯(lián)免疫檢測儀上以450nm波長測吸收值。按下式計算細胞相對增殖率(RGR)：RGR=（實驗組吸光值/空白對照組吸光值）100%對所得RGR按美國藥典細胞毒性分級標準對其進行毒性分級。美國藥典2（USPXXII24版）中細

9、胞相對增殖率與細胞毒性的分級的關系(下表)TherelationshipbetweencellproliferationrateandcytotoxicitygradeofUSP細胞相對增殖率()細胞毒性分級1000801502303043溶血試驗3.1采集新西蘭大白兔血4mL與2mL肝素（3000U/ml）混合備用。3.2實驗分組及檢測試驗分組：生理鹽水組(陰性對照)、實驗組（材料100%浸提液）和蒸餾水組(陽性對照組)。每組10個樣本，每個樣本5mL。取抗凝新鮮血液0.1mL分別加入3組樣品中，37培養(yǎng)箱孵育60min。觀察大體樣本溶血情況。低速離心機3000rmin10min，酶標儀49

10、2nm下對樣品進行OD值檢測。溶血率=(Dt-Dnc)(Dpc-Dnc)100按上述公式計算溶血率(Dt：待測OD值；Dpc：陽性對照OD值；Dnc：陰性對照OD值)。4統(tǒng)計分析對MTT法及溶血試驗測得各組吸光度值采用均數(shù)標準差表示，并行單因素方差分析，用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。結果1細胞毒性試驗1.11天后倒置顯微鏡下觀察A、B、C三組BMSCs生長狀態(tài)均良好，細胞多呈梭形或多角形（圖3）。D組細胞無明顯生長，基本開始變圓，皺縮（圖6）。表1：細胞相對增殖度和細胞毒性等級（1天）組別OD值(SD，n=10)細胞相對增殖度RGR(%)細胞毒性等級A空白對照組0.31880.02261

11、00.00B50%浸提液組0.30250.033194.90C100%浸提液組0.29960.013394.00D陽性對照組0.07540.009923.74“”示：與A組比較P0.05。1.2第3天可見前三組細胞數(shù)明顯較前增多，細胞逐漸聚集融合。三組細胞生長狀況均良好，無明顯差異（圖4）。D組細胞皺縮死亡。（圖6）。表2：細胞相對增殖度和細胞毒性等級（3天）組別OD值(SD，n=10)細胞相對增殖度RGR(%)細胞毒性等級A空白對照組0.43700.0532100.00B50%浸提液組0.44920.0506102.70C100%浸提液組0.45800.0793104.80D陽性對照組0.0

12、7490.003617.14“”示：與A組比較P0.05。1.3第5天鏡下見A、B、C三組BMSCs數(shù)量較前明顯增多，且呈梭形，三角形（圖5）。D組細胞成片死亡（圖6）。表3：細胞相對增殖度和細胞毒性等級（5天）組別OD值(SD，n=10)細胞相對增殖度RGR(%)細胞毒性等級A空白對照組0.69070.1105100.00B50%浸提液組0.65630.090995.00C100%浸提液組0.62560.149890.60D陽性對照組0.07190.001410.44“”示：與A組比較P0.05）（如表4），細胞毒性等級均為0級。2溶血試驗2.1樣本大體觀察生理鹽水組和實驗組靜置后各管內(nèi)均可

13、見血細胞沉積，而蒸餾水組各管顏色均一，呈淡紅色，無明顯血細胞沉積。2.2溶血率表5：吸光度值和溶血率(SD，n=10)生理鹽水組蒸餾水組實驗組OD值0.05110.01470.45360.02820.06780.0100溶血率0%100%4.1%生理鹽水組與實驗組OD值無明顯差異（P0.05）,與蒸餾水組有差異（P0.05），但均與陽性對照組有顯著差異（均P0.05）。而蒸餾水組各管顏色均一，呈淡紅色，表現(xiàn)為明顯溶血的現(xiàn)象，其OD值與生理鹽水組和實驗組均有顯著差異（均P0.05）。最終求得材料浸提液相對溶血率為4.1%，符合溶血率5%的標準要求7（ISO10993-4）。進一步補充說明了=1*

14、ROMANI型膠原-殼聚糖復合材料的無毒性。理想的骨組織工程支架材料除了對機體無毒性以外，還應具有良好的表面相容性，一定的生物活性，可降解性和良好的結構相容性等8（HunzikerE,1999）。所以對于=1*ROMANI型膠原-殼聚糖復合材料還需從這些方面進一步研究。圖3第1天：A，B，C三組細胞均生長良好，細胞呈梭形或三角形（100）圖圖2原代BMSCs細胞（100）三代BMSCs細胞（100）附圖：圖4第3天：，三組數(shù)量較前增多，生長良好（100）圖5第5天：，三組各孔趨于融合，細胞生長良好。圖6，分別表示第，天組變圓，固縮，死亡。參考文獻1ISO10993-5：1999Biologic

15、alevaluationofmedicaldevicesPart5：Testsforinvitrocytotoxicity2USPXXII24BilolgicalTests/BiologicalReactivityTests，Invivo3IsmarulIN,IshakY,IsmailZ,eta1CharacterizationofcollagenchitosanfilmsforskinregeneratingscaffoldMedJMalaysia2004；SupplB：57-58.4Rapidcolorimetricassayforcellulargrowthandsurvival:app

16、licationtoproliferationandcytotoxicityassaysJ.ImmunMeth,1983,65(1-2):55-63.5CiapettiG,GenniE,PratelliL,etal;Invitroevaluationofcell/biomaterialinteractionbyMTTassayM;Biomaterials,1993,14(5):359-364.6WatahaJC,HanksCT,CraigRG.Invitroeffectsofmetalionsoncellularmetabolismandthecorrelationbetweentheseeffectsandtheuptakeoftheions,J.Biomed.Mater