腫瘤實驗動物和細(xì)胞研究技術(shù)

1、腫瘤實驗動物和細(xì)胞研究技術(shù)腫瘤的實驗動物和細(xì)胞研究技術(shù)The animal model and in vitro research of tumor常用研究方式：In Vitro: 體外研究，細(xì)胞、組織培養(yǎng)下進(jìn)行In Vivo: 體內(nèi)研究，人類疾病的動物模型Ex Vivo: 細(xì)胞經(jīng)體外實驗處理后，再回輸?shù)襟w內(nèi) 體外處理：轉(zhuǎn)染基因或改變環(huán)境(用一些因子) 使其分化等 體外研究(In Vitro ) 原代培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞: 從腫瘤組織中分離得到的細(xì)胞在體外成功地進(jìn)行 培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)(primary culture)腫瘤細(xì)胞系:原代培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞能連續(xù)傳代（約710天傳代一次） 半年以上,生長穩(wěn)定, 并

2、能保持腫瘤細(xì)胞的特性， 稱為腫瘤細(xì)胞系(cell line)腫瘤細(xì)胞株:細(xì)胞系經(jīng)細(xì)胞克隆或其它方法獲得具有某種生物學(xué)特性 的純譜系的細(xì)胞稱為腫瘤細(xì)胞株(cell strain), 細(xì)胞具有 相同的基因型和表型(單克隆)腫瘤細(xì)胞株的建立： 1、 直接從人的腫瘤或動物的自發(fā)及誘發(fā)腫瘤組織分離培養(yǎng) 建系和建株; (從自發(fā)或誘發(fā)瘤) 2、從人或動物的移植腫瘤(如人腫瘤裸鼠移植瘤)組織分離 培養(yǎng)建系及建株; (從移植瘤) 3、用化學(xué)或生物(病毒)方法在體外轉(zhuǎn)化正常的人或動物的 細(xì)胞株而獲得腫瘤細(xì)胞株。(體外轉(zhuǎn)化)腫瘤細(xì)胞株的鑒定： 1. 有關(guān)的原始資料,包括供瘤病人的姓名、年齡、性別、病歷號、 臨床診斷

3、（TNM）、活檢病理診斷,手術(shù)切除日期、最后病理診斷等 2.形態(tài)學(xué)觀察: 普通倒置相差光鏡:活細(xì)胞的形態(tài), 細(xì)胞間橋,分泌顆粒,重疊生長, 形態(tài)與腫瘤細(xì)胞的生長條件有一定關(guān)系: HeLa: 高濃度血清長梭形; 低濃度血清圓形細(xì)胞,排列如鵝卵石路面; 透射和掃描電鏡 3D組織結(jié)構(gòu) 3. 核型及染色體觀察: 整倍體,異倍體,染色體畸變、標(biāo)記染色體,染色體分帶分析, 相隔一定時間重復(fù)觀察數(shù)次 4.生長特性: 分裂指數(shù)（3H-thymidine或5-BrdU的labeling index）、 生長曲線、 細(xì)胞群體倍增時間、 集落形成或貼壁率（plating efficiency） 半固體培養(yǎng)介質(zhì)中的集

4、落形成率 5.組織特性的鑒定: 免疫細(xì)胞化學(xué)方法 上皮性腫瘤標(biāo)志: CK、上皮膜抗原（EMA）、 癌胚抗原（CEA）; 淋巴瘤抗原標(biāo)志: 人白細(xì)胞分化抗原簇（CD）,有274個以上, T淋巴細(xì)胞: UCHL-1(CD45RO), B淋巴細(xì)胞: L26（CD20）, 軟組織腫瘤標(biāo)志：波形蛋白（Vm） 肌源性：結(jié)蛋白（Dm）、肌動蛋白、肌凝蛋白、肌紅蛋白 神經(jīng)源性： 神經(jīng)微絲（NF）、S-100蛋白、 Leu-7、 神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、髓磷脂堿性蛋白(MBP) 組織細(xì)胞源性： -1抗胰蛋白酶、 -1抗糜蛋白酶、CD68 血管源性：八因子相關(guān)抗原、CD34、荊豆凝集素(UL) 基膜源性：

5、纖連蛋白（FN）和層粘連蛋白（LN）體外培養(yǎng)時腫瘤細(xì)胞株有可能會失去原本表達(dá)的某些組織抗原,抗原標(biāo)志要多選用幾種抗體,以減少假陰性結(jié)果; 6. 其他特性： (a) 分泌激素和異位激素: 絨毛膜癌HCG 垂體瘤生長激素 肺燕麥細(xì)胞癌和一些甲狀腺癌ACTH 人肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞株（PLA-801）促性腺激素 肝癌HCG (b) 腫瘤細(xì)胞的受體表達(dá): ER PR AR (c) 酶及同工酶活性: 酶活性保持(HTC酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、變化 誘導(dǎo)劑 糖皮質(zhì)激素、多肽激素 改變培養(yǎng)條件：谷氨酸替代谷氨酰胺腦星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酰合成酶 活性增7倍左右 特異的同工酶譜： 絨癌T3M-3表達(dá)胎盤性堿性磷酸酶 (d)

6、癌基因及抑癌基因核酸及蛋白的表達(dá)： 高轉(zhuǎn)移人卵巢細(xì)胞系HO-8910PM 表達(dá)：p53 p16 bcl-2 nm-23 CD44v6 c-erbB-2 EGFR 等基因的蛋白產(chǎn)物 不表達(dá)：Bax基因的蛋白產(chǎn)物 7. 細(xì)胞株交叉污染的檢測： 細(xì)胞遺傳學(xué)方法： 染色體分析 特異的染色體標(biāo)志探針作FISH G帶核型分析鑒別同種腫瘤細(xì)胞 Q帶分析檢測人Y染色體 免疫學(xué)方法：HLA或動物的組織相容性抗原的測定 生化方法：同工酶譜或其它生化指標(biāo) 8. 微生物污染的檢測： 細(xì)菌：培液混濁，高倍鏡下隱約可見均勻散在細(xì)小菌體 真菌：培液混濁，高倍鏡下可見菌絲或孢子 病毒：病毒核酸和蛋白產(chǎn)物 支原體：以核酸（DN

7、A）熒光染色即H-stain(Hoechst 33258， 即二苯并咪唑染色)較為常用, 356nm光的激發(fā)下 可發(fā)出458nm的強熒光, 體外正常細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的鑒定 正常細(xì)胞體外惡性轉(zhuǎn)化的鑒定指標(biāo)(14項指標(biāo)) （第二屆全國細(xì)胞和組織培養(yǎng)專題討論會通過） 核型分析出現(xiàn)非整倍體 能在軟瓊脂培養(yǎng)基中增殖并形成集落 異種動物接種能生成腫瘤 端粒保持不變或延長以及端粒酶活性的增高 指標(biāo) 正常細(xì)胞 轉(zhuǎn)化的纖維母細(xì)胞 轉(zhuǎn)化的上皮細(xì)胞形態(tài) 伸展良好,折光較弱;核質(zhì)比小, 梭形,伸展較差,折光較強;核質(zhì)比大, 與正常細(xì)胞之間差別不如纖維母細(xì)胞 胞質(zhì)嗜堿性弱;核仁較小較少; 胞質(zhì)嗜堿性強,核仁較大較多;多核巨

8、細(xì)胞 大;多形性較常見 多核巨細(xì)胞較少 較多 粘附性 細(xì)胞間粘附性較強,緊貼瓶壁生長 粘附性差,易脫落 差別不明顯生長特性 排列有方向性,單層生長,存在密度 方向性消失,多層重疊,密度依賴性抑制消失 差別不明顯,某些細(xì)胞株呈重疊生長 依賴性抑制 對血清的依賴 較高 較低 差別不明顯掃描電鏡觀察 微絨毛少 微絨毛豐富 微絨毛不穩(wěn)定,有時增多 植物凝集素引起的凝集 弱 較弱 較強細(xì)胞表面的糖蛋白和糖脂 正常 糖基化不完全 糖基化不完全纖維連接蛋白 正常存在 減少或消失纖溶酶原激活酶 較低 增高 不穩(wěn)定,某些株增高胞質(zhì)中微絲微管的排列 規(guī)則 紊亂 不穩(wěn)定胞質(zhì)cAMP濃度 較高 較低 核型 二倍體 非

9、整倍體或假二倍體 非整倍體瓊脂培養(yǎng) 不生長 生長 生長接種異種易感動物 不長腫瘤 長腫瘤 長腫瘤 世界各國的細(xì)胞庫（cell bank）及索引 美國 美國典型培養(yǎng)細(xì)胞庫（American Type Culture Collection, 即ATCC, Rockville,MD） 人與動物細(xì)胞培養(yǎng)目錄（Catalog of Human and OtherAnimal Cell Cultures, Naval Biosciences Laboratory, Cell Culture Department, Naval Supply Center, Oakland,CA) 人基因突變細(xì)胞及老年細(xì)胞培

10、養(yǎng)庫（Human Genetic Mutant Cell Culture and Ageing Cell, Culture Repositories, Institute for Medical Research, Camden, NJ) 歐洲 真核細(xì)胞培養(yǎng)庫(Culture de Cellules Eucaryotes, Repertoire des Utilisateurs., M. Adophe, D. Gourdji, A.Tixier-Vidal, R. Robineaux, Inserm Publications,101 Rue de Tobiac,75654 Paris, Ced

11、ex 13 醫(yī)學(xué)病毒學(xué)系（Department of Medical Virology,Institute de Pasteur, Paris) 歐洲動物細(xì)胞培養(yǎng)庫（European Collection for Animal Cell Cultures,即ECACC, PHLS/CAMR, Porton, Salisbury, England) 歐洲人類基因突變細(xì)胞庫(European Human GeneticMutant Cell Bank, Department of Clinical Genetics, Erasmus University, Rotterdam) 日本 癌細(xì)胞系庫(

12、Collection of Cancer Cell lines, National Institute of Hygenic Sciences, Tokyo) 普通細(xì)胞庫( General Cell Bank, Institute of Physical and Chemical Research of RIKEN, Saitama) Flow Laboratories; GIBCO特殊表型腫瘤細(xì)胞系（株）： 高轉(zhuǎn)移 人肝細(xì)胞性肝癌細(xì)胞株MHCC97 人黑色素瘤細(xì)胞株MV3、 卵巢癌細(xì)胞株HO-8910PM、 肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞株P(guān)GBE1 高度耐藥 分泌產(chǎn)生激素、蛋白、酶或一些因子 人肺小細(xì)胞癌

13、細(xì)胞株LU-165抗利尿激素; 人肺腺癌細(xì)胞株LC-2/ad1-抗胰蛋白酶 人紅白血病細(xì)胞株K562高表達(dá)端粒酶 體內(nèi)研究(In Vivo) 腫瘤動物模型： 自發(fā)性腫瘤 誘發(fā)性腫瘤 移植性腫瘤. 一、自發(fā)性腫瘤 種系：大鼠的自發(fā)腫瘤不如小鼠多見，大動物更為少見 Sinclair豬到一歲時有85%可發(fā)生惡性黑色素瘤 品系： C3H小鼠 乳腺癌發(fā)病率為97% BALB/c 乳腺癌發(fā)病率低 AKR小鼠 淋巴細(xì)胞性白血病發(fā)病率為70%90% 近交系SJL/J小鼠 淋巴瘤(何杰金病)自發(fā)率高達(dá)91% 缺點：發(fā)病遲,發(fā)病時期不集中,發(fā)病率也不穩(wěn)定 二、誘發(fā)性腫瘤 優(yōu)點：發(fā)生率、發(fā)病時間、發(fā)生部位及組織學(xué)類

14、型均易控制 實驗結(jié)果重復(fù)性相對較好 1775年英國醫(yī)師Pott 掃煙囪 陰囊癌 1914年,日本學(xué)者山極和市川 煤焦油 皮膚癌 1934年Yashida用鄰氨基偶氮甲苯誘發(fā)大鼠肝癌成功 我國從1960年代開始進(jìn)行化學(xué)誘癌動物模型的研究 1956年亞硝胺和1961年黃曲霉毒素的致癌作用相繼被發(fā)現(xiàn) (1) 化學(xué)致癌物 誘發(fā)時間相對較短 有劑量-效應(yīng)關(guān)系 基因毒化學(xué)致癌物一般具有高度親電子性， 與生物大分子中富于電子的親核殘基相結(jié)合, 影響鹼基對的正常配位或大分子的結(jié)構(gòu)與功能 正常細(xì)胞的癌變. 直接致癌物和前致癌物（間接致癌物） 常見化學(xué)致癌物: 1) 多環(huán)碳?xì)浠衔? 25種以上, 以煤焦油的主要

15、成分3,4-苯并芘 和3-甲基膽蒽的致癌性最強 2) 氨基偶氮化合物: 二甲基氨基偶氮苯亦稱二甲基黃(奶油黃), 3-甲基-4,4-二甲基氨基偶氮苯(3-Me-DAB) 3)芳香胺類: 苯胺印染工廠 吸入乙萘胺在肝變?yōu)榘被浇?jīng)腎排出 聯(lián)苯胺膀胱癌 2-乙酰氨基芴(2-AAF) 4)亞硝胺類: 亞硝酸鹽+二級胺亞硝胺類化合物 強致癌物 致癌譜甚廣 不同分子的亞硝胺化合物仍有一定的器官親和性 對稱衍生物如二烷基亞硝胺肝癌 不對稱的亞硝胺食管癌 5)霉菌毒素: 種類較多 首推黃曲霉毒素(aflatoxin),存在于霉變的花生、 玉米及谷物中, 6)金屬元素 : 砷、鉻、鎳、肺癌 鎘前列腺癌. (2)

16、影響化學(xué)致癌的因素 1) 動物方面品系: 誘發(fā)肝癌時：F-344大鼠對DEN和2-AAF的敏感性要比其它品系的大鼠高 誘發(fā)皮膚腫瘤：BALB/c和SENCAR品系小鼠對DMNU、DENU的敏感性 大大高于Swiss品系小鼠性別: 2AAF誘發(fā)肝癌：小鼠60%發(fā)生肝癌,小鼠不敏感. F-344大鼠,比更敏感年齡: 一般而言,動物年齡越小,對化學(xué)致癌物越敏感, 敏感性： 胎鼠新生鼠成年鼠2) 化學(xué)致癌物方面劑量閾值: 啟動因子（initiator）不表現(xiàn)明顯的劑量閾值 促癌因子（promotor）則有劑量閾值 一般的化學(xué)致癌物往往兼有啟動和促癌的作用,因此仍可表現(xiàn)有劑量閾值 如3-Me-DAB (

17、60ppm)致癌強度: 誘發(fā)大鼠肝癌總劑量: DAB為1000mg 3-Me-DAB為600mg, 2-AAF為250mg, DMN只需100mg; 誘癌潛伏期: 誘發(fā)肝癌：AFB1需時約1年, 3-Me-DAB與2-AAF約半年左右, DEN一般只需3個月;誘癌靶器官: 誘癌譜：相對專一，如3-Me-DAB一般只引起肝癌, 較廣，如亞硝胺類可誘發(fā)多器官腫瘤; 化學(xué)致癌物的相互作用: 多數(shù) 協(xié)同作用而加速致癌, 少數(shù) 會產(chǎn)生拮抗作用. 有的化學(xué)物質(zhì)單獨使用時本身不致癌,但可增強致癌物作用（促癌物） 3)誘癌方案（carcinogenic regimen）和方法 半年后12周后喂正常飼料(代表1

18、周)喂含0.06%3Me-DAB的飼料喂含0.02%2-AAF的飼料部分肝切除苯并蒽(Benzanthracene)直接涂擦皮膚注射至皮下產(chǎn)生皮膚癌產(chǎn)生纖維肉瘤 非基因毒致癌物(non-genotoxic carcinogen) 美國公布的301種化合物中,162種可致鼠類腫瘤 其中 36%不引起細(xì)胞DNA的改變 44%不引起細(xì)胞突變 致癌機制？ 促進(jìn)細(xì)胞增殖？ 抑制細(xì)胞凋亡？ 其它未知？2 生物因子誘發(fā)動物腫瘤模型 (1) 病毒誘發(fā)動物腫瘤模型 1908年Ellermann和Bang 白血病雞的無細(xì)胞濾液誘發(fā)雞白血病獲成功 白血病、淋巴瘤、肉瘤、乳腺癌、皮膚癌、腎癌等,與病毒感染有關(guān) 1)

19、DNA病毒 多瘤病毒(PyV) 皰疹病毒(herpes virus sylvilagas) 2) RNA病毒 急性RNA腫瘤病毒：潛伏期較短(34周),大部分肉瘤病毒、禽白血病病毒、 個別小鼠白血病病毒(如Abl-MuLV)都屬于本組. 該組病毒基因組結(jié)構(gòu)常有缺陷,需輔助病毒協(xié)助才能復(fù)制 慢性RNA腫瘤病毒： 潛伏期較長(412月)，大部分動物白血病病毒屬于本組 （2）其它生物因子誘發(fā)的動物腫瘤模型 幽門螺桿菌感染SPF級的BALB/c小鼠,22月以后, 38%的實驗小鼠胃有淋巴濾泡增生, 25%的小鼠胃出現(xiàn)形態(tài)類似人胃粘膜相關(guān)淋巴瘤的病變 （B細(xì)胞淋巴瘤） 3. 轉(zhuǎn)基因動物腫瘤模型 Stew

20、art等獲得13個MMTV-LTR/myc融合基因的轉(zhuǎn)基因小鼠系, 其中兩株c-myc啟動子為MMTV-LTR啟動子中糖皮質(zhì)激素受體 反應(yīng)元件所取代,在早期妊娠時即發(fā)生自發(fā)性乳腺癌。 Chisari等 HHBV的S基因、病毒增強子和X基因轉(zhuǎn)基因小鼠, HBsAg的積聚引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴張,出現(xiàn)肝細(xì)胞毛玻璃樣改變, 100%小鼠發(fā)生肝臟腫瘤 X基因和病毒增強子的質(zhì)粒X基因轉(zhuǎn)基因小鼠, 21月齡時, 兩個品系轉(zhuǎn)基因小鼠肝腫瘤發(fā)生率分別為 75% 82.8% 三、移植性腫瘤 可移植瘤株：將一種動物腫瘤移植到同系同種或異種動物,經(jīng)傳 代（20代）, 組織形態(tài)特征逐漸穩(wěn)定，即成為同種 或異種動物的可移植瘤

21、株。 移植瘤來源：動物自發(fā)性腫瘤或誘發(fā)性腫瘤 我國用615近交系小鼠的自發(fā)瘤建立了： 肺癌、肝癌、乳腺癌、白血病等移植瘤株 用誘發(fā)瘤建立了： 小鼠宮頸癌（U27及U14） 小鼠前胃癌（Fc） 肝細(xì)胞癌等移植瘤株。 近交系動物的應(yīng)用： 1962年,蘇格蘭醫(yī)師Dssacson和 Cattanach發(fā)現(xiàn)（裸小鼠） *移植性人腫瘤裸鼠模型廣泛應(yīng)用 1、免疫缺陷動物 (1) T細(xì)胞免疫功能缺陷動物 裸小鼠：*先天性胸腺發(fā)育不良(妊娠1415天可見少量胸腺 痕跡,并非全無胸腺) *胸腺依賴性T細(xì)胞明顯減少或缺乏, *B細(xì)胞仍然存在,但功能低下,免疫球蛋白以IgM為主, *NK細(xì)胞有較強活力。 純合子的裸大

22、鼠：基因符號rnu。特征與裸小鼠相似 無胸腺大鼠(2)B細(xì)胞免疫功能缺陷動物 B細(xì)胞功能衰退,血漿IgM、IgG低下,T細(xì)胞功能尚屬正常 CBA/N系小鼠 Arabian和Quarter馬(3)聯(lián)合免疫缺陷及其它免疫缺陷動物 CBA/NNU小鼠 T、B淋巴細(xì)胞功能均缺陷; 嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠（SCID）：突變基因scid位于第16對染色體 純合子小鼠T、B淋巴細(xì)胞極度低下, NK細(xì)胞和抗原傳遞細(xì)胞功能尚正常 先天性聯(lián)合免疫缺陷型小鼠： NK細(xì)胞、T、B細(xì)胞功能聯(lián)合缺陷裸小鼠： 缺點：*需在 germ-free或SPF條件下飼養(yǎng)，較苛刻 *平均壽命僅1430d。2、人腫瘤免疫缺陷動物模型 移植

23、成功率: 取決于 移植方法：人癌組織直接移植的成功率平均為30% 人癌細(xì)胞株為6070% 腫瘤本身：成功率最高結(jié)腸癌、胃癌、黑色素瘤; 其次胰腺癌裸小鼠胰腺內(nèi)原位移植、宮頸癌、食管癌等; 較低前列腺癌、乳腺浸潤癌、淋巴網(wǎng)織系統(tǒng)腫瘤和白血病 裸小鼠品系：人前列腺癌BALB/c成功率僅2%（3/150） NMRI裸小鼠可達(dá)35%（6/16） 其它： 接種部位 宿主遺傳背景 年齡和建康狀況等(1)人組織裸鼠誘癌模型 誘發(fā)鼻咽癌 青少年慢性鼻咽增殖體炎鼻咽活檢或刮除組織移植于NC系裸小鼠 二亞硝基哌嗪（NDP）為致癌劑 鼻咽上皮增生 巴豆油A因子（TPA）為促癌劑 乳頭狀增生、不典型增生 原位癌 誘發(fā)

24、肺癌 裸鼠體內(nèi)人類氣管、支氣管培養(yǎng)成功也為用人材料誘發(fā)肺癌的實驗奠定了基礎(chǔ)(2)人腫瘤裸鼠移植模型 *1969年丹麥的Ryggard 人結(jié)腸癌移植于裸小鼠 *100余種人類惡性腫瘤裸小鼠移植模型： 癌腫 肝、肺、胃、結(jié)腸、食管、胰腺、乳腺、 前列腺、鼻咽、 淋巴造血系統(tǒng)腫瘤 軟組織腫瘤 其它 黑色素瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤*1978年Festing首次進(jìn)行裸大鼠人癌異種移植*1983年我國建成甲胎蛋白陽性裸大鼠人肝癌模型LTNR與LTMR2兩株(3)人腫瘤轉(zhuǎn)移裸鼠模型 我國始于80年代中期 肺癌、肝癌轉(zhuǎn)移及胃癌肝轉(zhuǎn)移和淋巴道轉(zhuǎn)移等1)人肺癌高轉(zhuǎn)移裸小鼠模型 吳秉銓等將6株人肺癌細(xì)胞系移植BALB/c

25、A,nu/nu/JCLB裸小鼠 其中一株肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞系移植建成高轉(zhuǎn)移模型,定名為PG 帶瘤存活30天以上裸小鼠中 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(29/30) 肺轉(zhuǎn)移(26/30) 傳17代后,瘤組織再移植裸小鼠(存活30天) 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 (12/12) 肺轉(zhuǎn)移(9/12) 轉(zhuǎn)移率達(dá)100%2)人肝癌高轉(zhuǎn)移裸小鼠模型 孫肪憲,湯釗猷等用30例人肝癌組織直接移植于46周齡的BALB/cA,nu/nu裸小鼠, 移植部位在小鼠肝實質(zhì)內(nèi)或肝包膜下 其中一例39歲男性(巨塊型肝細(xì)胞癌伴肝內(nèi)播散和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)其移植瘤育成 人肝癌高轉(zhuǎn)移裸鼠模型,定名為LCI-D-20 鼠間連續(xù)傳代(16代)成功率100%,間期為20天 肺、

26、淋巴結(jié)及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移(72/72), 腹腔種植轉(zhuǎn)移(50/72), 轉(zhuǎn)移率達(dá)100% 3)其它 胃癌肝轉(zhuǎn)移 楊善民等用人低分化胃粘液腺癌細(xì)胞系MGC80-3在BALB/c裸小鼠建成移植瘤后 再用移植瘤單細(xì)胞懸液接種于裸小鼠脾包膜下 肝內(nèi)胃癌轉(zhuǎn)移率達(dá)60% 用CCl4處理裸小鼠,肝內(nèi)胃癌轉(zhuǎn)移率可達(dá)100%,其它臟器則未見轉(zhuǎn)移 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 李斯德等將人小細(xì)胞癌NCI-H128細(xì)胞系接種裸小鼠 腹股溝、腋窩和頜下淋巴結(jié)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率達(dá)100%3 應(yīng)用 腫瘤的生物學(xué)特性 浸潤轉(zhuǎn)移 臨床治療 基因治療 導(dǎo)向治療 藥敏測定法（SRC） 實驗可評價率為93% 新抗癌藥物開發(fā)篩選 Molecular On

27、cology Some Molecular Methodology in Tumor Research一、基因變異的診斷 基因表達(dá)異常 腫瘤 基因突變：轉(zhuǎn)位，重排 Southern blot，PCR 點突變 DGGE 鹼基缺失 CDGE SSCP 基因丟失：SSCP Microsatellites analysisDGGE=Denaturing Gradient Gel ElectrophoresisCDGE=Constant Denaturing Gel ElectrophoresisSSCP=Single Strand Conformation PolymorphismPCR-SSCP:

28、year 1989, Orita MGene PCR Homozygote HetrozygoteHeating(50) for 10 min + formamideNon denaturing PAGE(300V,5h, silver staining)PCR-SSCP靈敏度高，一個鹼基的改變可在電泳速度上反映出來但DNA片段的大小與靈敏度有關(guān)100-300 bp 突變檢出率 97%300-500 bp 檢出率 67%以200 bp 左右為佳PCR-SSCP的主要步驟：DNA模板制備（從石蠟組織中提取） 脫蠟：少許石蠟組織放入Eppendorf管+1ml 二甲苯 65，5 分鐘離心，5分鐘，

29、棄上清 重復(fù)一次 1 ml EtOH,振搖后離心5分鐘，棄上清 1 ml EtOH(70%),振搖后離心5分鐘，棄上清 真空離心5分鐘，使干燥 消化： 180ml pH8.0 TE +20ml buffer +10ml proteinase K(20mg/ml) 55,3-5h 加50ml Chelex-100(25%水溶液) 55 ,1h 100, 10 min spin,3 min提純DNA： 上清+ 200ml phenol,劇烈振搖 離心，3 min 上清+phenol/choroform,振搖 離心，3 min 水相+25ml NaOAc 3M,1ml glycogen,750mlE

30、tOH(pure) -20, over night spin 15 min,at 4 pellets washed with EtOH70% spin, pellets resuspended in 100-200ml TE,pH82. Run PCR 注意：PCR產(chǎn)物最好在200 bp左右 瓊脂糖電泳條帶清晰PCR產(chǎn)物 run 非變性PAGE 制膠（36%MDE 膠，or 6% polyacrylamide） 稀釋樣品（1mlPCR產(chǎn)物+4ml去離子水） alkaline denature, (+1ml NaOH,4ml去離子水） 50水浴10min后+stop solution 2ml )

31、 12ml/well 20恒溫，300伏恒壓下電泳5h Alkaline stock solution:0.5 M NaOH+10mMEDTAStop solution:1ml formamide(99%pure)+20ml 0.5M EDTA(pH8.0)+50ml 1% bromophenol+25ml 1% xylene cyanol4. 膠染色 PAGE膠作記號（左下角切去?。┤?0%醋酸固定20min 膠用去離子水洗三次，每次2min 膠入硝酸銀溶液反應(yīng)30min 膠用去離子水洗一次，約半分鐘 膠入還原液還原顯色（時間依需要而定） 膠入10%醋酸終止反應(yīng)，約5分鐘 膠在80下真空干燥

32、2小時P53基因exon5突變（PCR-SSCP） N T L N T LPCR-SSCP的應(yīng)用： 1. 經(jīng)PCR-SSCP確定DNA片段有突變，該片段經(jīng)測序可確定突變的形式和定位，可避免因測序或PCR反應(yīng)出現(xiàn)的堿基配對差錯造成的假陽性 2. 在無非特異性電泳條帶情況下，可以初步確定有無基因的雜合性丟失（Loss of Hetrozygote, LOH)二、檢測基因的丟失和擴增 比較基因組雜交 Comparative Genomic Hybridization,CGH 分子生物學(xué)技術(shù)與細(xì)胞遺傳學(xué)方法相結(jié)合 優(yōu)點： 1. 新鮮材料和福爾馬林固定石蠟包埋材料均可 進(jìn)行CGH研究 2. 被測樣品只需

33、數(shù)mg甚至不到1 mg的DNAR/G 低度擴增 高度擴增 丟失不同熒光（紅/綠）標(biāo)記基因組DNA片段（500-2000 bp）人Cot-1 DNA對正常人染色體進(jìn)行原位分子雜交被測DNA參照DNA退火及預(yù)雜交石蠟包埋材料提取的DNA質(zhì)量較差，可用變性引物對所提取的基因組DNA進(jìn)行整體擴增Degeneration Oligonucleotide Primed PCR(DOP-PCR)First step: Primer: 5CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3(DOP)酶：消除35外切酶活性的T7噬菌體DNA聚合酶條件：寬松條件（Low stringency) 30/5 min37/

34、2 min96/2 min for 5 cyclesSecond step:Template: the product of the first step runningPrimer: DOP酶： Taq聚合酶條件：95/5 min 后進(jìn)入循環(huán) 94/1 min56 /1 min72/2 min for 35 cycles 72 /5 min用DOP-PCR只需石蠟包埋材料DNA50 pg(相當(dāng)于5-10個細(xì)胞）即可進(jìn)行CGH分析，而常規(guī)方法需至少200個細(xì)胞，兩者CGH的圖形（profile)是相同的切片染色不能用HE，而用甲基綠CGH的應(yīng)用：為搜尋腫瘤的癌基因或抑癌基因確定范圍腫瘤細(xì)胞染色

35、體某一位置上DNA序列拷貝數(shù)增加，往往提示該位置可能包含已知或未知的癌基因有擴增腫瘤細(xì)胞染色體某一位置上DNA序列拷貝數(shù)減少或缺失，提示該位置可能包含已知或未知的抑癌基因丟失 CGH發(fā)現(xiàn)MYCN，MET與胃癌相關(guān)區(qū)分良惡性病變，臨床上估計預(yù)后 16例前列腺癌CGH顯示染色體異常占81% 5例良性前列腺增生全部陰性 67肝細(xì)胞癌CGH顯示:1q,8q,20q,17q 4q,8p,13q,16q 12例癌周肝硬化組織：陰性 53例淋巴結(jié)陰性乳腺癌：8q,11q13,17q,20q異常，預(yù)后差 三、檢測細(xì)胞基因表達(dá)譜的差異 消減雜交 抑制消減雜交 cDNA 代表性差異分析 SAGE DNA micr

36、oarray mRNA差異顯示（mRNA differential display) RT-PCR + 測序電泳，經(jīng)典，可重復(fù)性 可展示10000-15000種mRNA的表達(dá)實質(zhì)是RT-PCR引物設(shè)計很有特點錨定引物： 12個T可結(jié)合mRNA 的polyA上T12MN M=A，G，C N= A，G，C，T 據(jù)排列組合，一種T12MN可與1/12的mRNA結(jié)合隨機引物：可在與poly A末端不同距離的多個位置上結(jié)合 差異顯示的產(chǎn)物是長度不一的cDNA片段的混合物 差異顯示的技術(shù)路線 提取高質(zhì)量的總RNA，DNA酶處理 用錨定引物T12MN進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄 用相同的T12MN引物及隨機引物進(jìn)行PCR擴增

37、 （同時用同位素對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記） 測序膠電泳分離PCR產(chǎn)物 切下差異表達(dá)的條帶，用相同引物進(jìn)行二次PCR擴增 PCR產(chǎn)物制成探針 Northern blot驗證 *相對較敏感：200個細(xì)胞的總RNA足夠進(jìn)行差異分析*低豐度mRNA 的顯示不理想 對策： （1）先通過消減雜交使差異片刻富集 （2）二輪PCR擴增（巢式PCR），第二輪的引物 在3端多2個堿基，使與之匹配的模板減少， 模板間競爭減少，有利于低豐度mRNA擴增 *降低假陽性：使用不同濃度的模板進(jìn)行平行反應(yīng)，或重復(fù)實驗以排除由于模板質(zhì)量或數(shù)量引起的假陽性；嚴(yán)格設(shè)定對照，如用缺省逆轉(zhuǎn)錄酶或RNA酶降解RNA作為陰性對照來排除DNA污

38、染；進(jìn)行差異片段的初篩，把所有的差異片段點在尼龍膜上，然后將研究對象RNA逆轉(zhuǎn)錄，摻入同位素制成探針，與此尼龍膜雜交（即反向點雜交），只有那些“此有彼無”的片段才進(jìn)入下一階段的研究。差異表達(dá)分析的應(yīng)用 *腫瘤與瘤旁組織或正常組織的基因表達(dá)差異表達(dá)分析 *不同生物學(xué)特性的腫瘤（高、低轉(zhuǎn)移表型）基因表達(dá) 差異分析 *細(xì)胞經(jīng)某種細(xì)胞因子處理后進(jìn)行基因表達(dá)差異分析， 研究該細(xì)胞因子作用的下游分子四、蛋白組學(xué)及生物芯片蛋白組學(xué)（proteomics) Y-軸等電電泳或固態(tài)pH2-D gel electrophoresis 梯度電泳 X-軸SDS 銀染或熒光染色，找出差異點，挖膠 質(zhì)譜分析，微量氨基酸測序

39、 BLAST確定是已知還是未知的基因，克隆該基因生物芯片（biochip)是指采用光導(dǎo)原位合成或微量點樣等方法將大量核酸片段（寡核苷酸、cDNA、基因組DNA、RNA）或多肽分子甚至細(xì)胞等生物樣品有序地固定于支持物（玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝膠、尼龍膜等載體）的表面，組成密集的二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器如激光共聚焦掃描或電荷偶聯(lián)攝影像機（CCD）對雜交信號的強度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量改變。 生物芯片： 基因芯片 蛋白質(zhì)芯片 細(xì)胞芯片 組織芯片基因芯片( Affymetrix 專利） 寡核苷酸芯片，cDNA芯片，基因組芯

40、片 DNA microarray:陣密度很高的玻片基質(zhì)或膠膜基質(zhì) 的DNA微陣列 DNA macroarray:陣密度較低的尼龍膜DNA微陣列 五、 腫瘤基因甲基化水平的檢測Methylation of DNA:甲基化程度與該基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)甲基化可通過直接或間接作用影響基因表達(dá) 直接作用：基因構(gòu)型改變，影響轉(zhuǎn)錄因子與DNA特定 部位結(jié)合； 間接作用：調(diào)控序列甲基化，可與methyl GC-binding protein結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)錄因子與基因形成轉(zhuǎn) 錄復(fù)合物 甲基化檢測方法Hpa II +Msp I 酶切法 Hpa II -CCGG- Msp I -CCmGG- 通過電泳分析酶切片段即可知甲

41、基化狀態(tài) 5-氮胞苷摻入法： 5-氮胞苷胞嘧啶第五位C原子被N原子替代，胞嘧啶無法甲 基化基因低甲基化（可傳代） 經(jīng)5-氮胞苷處理的細(xì)胞，失活的基因可被重新激活 Xiong和 Laird用“COBRA”，即“結(jié)合應(yīng)用酸式亞硫酸鹽的內(nèi)切酶分析”（combined bisulfite restriction analysis,COBRA）來檢測啟動子中含有CpG的基因的甲基化水平。 COBRA原理：酸式亞硫酸鈉（CT）或（mCC） 與CpG甲基化有關(guān)的內(nèi)切酶位點的序列發(fā)生轉(zhuǎn)變CGCGmCGmCGCGCGCGCGTGTGCGCGTGTGTGTGBisulfiteBstU1注意：也有例外有些基因雖有甲

42、基化但仍可轉(zhuǎn)錄，相反有些基因雖處于低甲基化狀態(tài)，但沒有轉(zhuǎn)錄活性。Thank you for attendingSuggested topics be focused on in the discussion courseWhat will you add to the list of the approaches and techniques that I have presented, if you have, please give some details.What is your Ph.D. research proposal? What kinds of methods and te

43、chniques you intend to use in your research? What are the problems you may encounter and how to solve them?How much do you know about RNAi technique? Will you give us some points.See you next week !RNAi techniqueTwo types of 21 nt RNAs trigger posttranscriptional gene silencing in cells: small interfering RNAs (siRNA) microRNAs (miRNAs) DicerDouble-stranded RNA precursor siRNA or miRNADicer= a member of the RNAase III family of dsRNA-specific endonucleasesThe precursor of a miRNA (pri-miRNA) is transcribed in the nucleus. It forms a stem-loop structure that is processed to f