實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)

1、實(shí)時(shí)(sh sh)定量PCR技術(shù) 韓東洺 2015-07-08共三十五頁(yè)目錄(ml)實(shí)時(shí)(sh sh)定量 PCR介紹熒光PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Quantitative Real-time PCR技術(shù)的應(yīng)用共三十五頁(yè)P(yáng)CR PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是體外酶促合成特異DNA片段(pin dun)的一種方法。由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)等特點(diǎn)。共三十五頁(yè)實(shí)時(shí)(sh sh)定量 PCR 實(shí)時(shí)定量 PCR (Quantitative real-time PC

2、R) 是1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出的一種新技術(shù)。是指在 PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè) PCR 進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)(biozhn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。共三十五頁(yè) 與傳統(tǒng)PCR一樣用同樣的基本成分： 雙鏈DNA，引物，dNTPs，PCR buffer，Taq酶等。 與傳統(tǒng)PCR一樣，反應(yīng)在溫度模塊里循環(huán)(xnhun)進(jìn)行： 雙鏈DNA模板變性 引物與模板堿基互補(bǔ)-退火 引物延伸 新的擴(kuò)增片段共三十五頁(yè)基本原理 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 是在反應(yīng)體系(tx)中加入熒光基團(tuán)，使產(chǎn)物的數(shù)量與檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度成線性關(guān)系，從而得出產(chǎn)物的

3、擴(kuò)增曲線。理想的擴(kuò)增曲線應(yīng)為J 型，符合2 N 方程(其中 N 為 PCR 的循環(huán)次數(shù))，但實(shí)際上擴(kuò)增曲線為 S 型。 在 PCR 反應(yīng)早期，不能將產(chǎn)生熒光的水平與背景明顯區(qū)別，之后(zhhu)熒光的產(chǎn)生進(jìn)入指數(shù)期、線性期和最終的平臺(tái)期，因此可以在指數(shù)期的某一點(diǎn)上檢測(cè) PCR 產(chǎn)物的量，并由此推斷起始模板含量。共三十五頁(yè)主要(zhyo)類型根據(jù)Quantitative real-time PCR的化學(xué)發(fā)光原理可以分為2大類：1、探針類 包括TaqMan探針和分子信標(biāo)，利用與靶序列特異雜交的探針來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加(zngji)；2、非探針類 其中包括如SYBR Green I或者特殊設(shè)計(jì)的引物

4、 (如 LUX Primers) 通過熒光染料來(lái)指示產(chǎn)物的增加。共三十五頁(yè)Taqman 探針(tn zhn)法Taqman 探針(tn zhn)法是最早用于定量的方法。特異性的熒光探針：該探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。探針的5端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)(Reporter, R)，3端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher, Q)。該探針在 PCR過程中不能被延伸。每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。報(bào)告信號(hào)的強(qiáng)度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。因此該技術(shù)可對(duì)模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量。共三十五頁(yè)Taqman 探針(tn zhn)法共三十五頁(yè)S

5、YBR Green 法SYBR Green I 是一種能結(jié)合到 dsDNA 小溝部位的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料，與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)。這一性質(zhì)使其用于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)非常(fichng)理想。SYBR Green 法是非特異性檢測(cè)擴(kuò)增序列的代表。共三十五頁(yè)SYBR Green 法局限性：可與所有雙鏈DNA序列結(jié)合，從而降低了特異性。 為避免假陽(yáng)性信號(hào)，應(yīng)使用熔解曲線（melting curve） 或凝膠分析來(lái)檢查(jinch)非特異性產(chǎn)物的構(gòu)成。共三十五頁(yè)熔解(rn ji)曲線擴(kuò)增反應(yīng)完成后，通過逐漸增加溫度同時(shí)監(jiān)測(cè)(jin c)每一步的熒光信號(hào)來(lái)產(chǎn)生熔解曲線。隨著反應(yīng)中雙鏈DNA的

6、變性，熒光染料又恢復(fù)到游離狀態(tài)導(dǎo)致熒光信號(hào)降低，用熒光信號(hào)改變的負(fù)的一次導(dǎo)數(shù)與溫度作圖，在擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度上有一特征峰（Tm，DNA雙鏈解鏈50%的溫度），用這個(gè)特征峰可將特異產(chǎn)物與其他產(chǎn)物如引物二聚體區(qū)分開，因?yàn)樗鼈冊(cè)诓煌瑴囟热劢狻９踩屙?yè)熔解(rn ji)曲線如果熔解曲線做出來(lái)的只有單峰，而且出峰的位置所對(duì)應(yīng)(duyng)的退火溫度與所需退火溫度相同，那么該熒光數(shù)據(jù)有效。只有一個(gè)的峰=沒有多余的產(chǎn)物熒光溫度可能是引物二聚體共三十五頁(yè)SYBR Green法和Taqman探針(tn zhn)法比較共三十五頁(yè)Quantitative Real-time PCR與常規(guī)(chnggu)PCR的比

7、較共三十五頁(yè)熒光(ynggung)PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)共三十五頁(yè)實(shí)驗(yàn)(shyn)操作注意事項(xiàng)預(yù)防RNA酶的污染：全程佩戴一次性手套、口罩，少說話。使用DEPC（焦碳酸二乙酯）處理并滅菌的器材。Mix配制：試劑不要反復(fù)凍融，若經(jīng)常使用，最好(zu ho)放在4度。每管或每孔都要換新槍頭！所有成分加完后，離心去除氣泡。共三十五頁(yè)Real-time PCR引物設(shè)計(jì)(shj)原則共三十五頁(yè)Taqman探針(tn zhn)設(shè)計(jì)原則G共三十五頁(yè)反應(yīng)(fnyng)體系優(yōu)化誤差控制(kngzh)配置預(yù)混體系設(shè)置 生物學(xué)重復(fù)（不同個(gè)體） 技術(shù)性重復(fù)（復(fù)孔）陰性對(duì)照共三十五頁(yè)實(shí)時(shí)(sh sh)熒光定量檢測(cè)系統(tǒng) 實(shí)時(shí)(s

8、h sh)熒光定量 PCR 儀普通(ptng)PCR儀7500型熒光定量?jī)x共三十五頁(yè)工作(gngzu)流程無(wú)論是哪個(gè)型號(hào)，所有的定量PCR儀器(yq)都有三個(gè)共同的組成部分：共三十五頁(yè)在擴(kuò)增的過程中，熒光信號(hào)(xnho)隨著PCR產(chǎn)物的增加而增強(qiáng)。共三十五頁(yè)每個(gè)循環(huán)結(jié)束后，定量PCR儀器通過(tnggu)不同的濾光片記錄熒光信號(hào)的增加。共三十五頁(yè)最后(zuhu)，定量PCR軟件計(jì)算出數(shù)據(jù)，用于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。基因(jyn)表達(dá)共三十五頁(yè)數(shù)據(jù)分析 常見(chn jin)參數(shù) 基線(baseline)：一般來(lái)講，第3-15個(gè)循環(huán)(xnhun)的熒光值就是基線。 熒光閾值(threshold)：PC

9、R反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold = 10 SD cycle 3-15 。 Ct 值(Ct value)：C代表Cycle，t代表threshold，因此也稱閾值循環(huán)(threshold cycle)。Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。所以Ct值是一個(gè)沒有單位的參數(shù)。共三十五頁(yè)影響(yngxing)Ct值的關(guān)鍵因素 模板濃度：模板濃度是決定Ct值的最主要因素?？刂圃谝粋€(gè)合適范圍內(nèi)，使Ct值在15-35之間。 反應(yīng)液成分的影響：任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素影

10、響比如溶液(rngy)的pH值和鹽濃度。 PCR反應(yīng)的效率：PCR反應(yīng)的效率也會(huì)影響Ct值。在PCR擴(kuò)增效率低的條件下進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋擴(kuò)增，與PCR擴(kuò)增效率高的條件下相比，可能會(huì)所產(chǎn)生斜率不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 PCR效率取決于實(shí)驗(yàn)、反應(yīng)混合液性能和樣品質(zhì)量。一般說來(lái)，反應(yīng)效率在90-110%之間都是可以接受的。共三十五頁(yè)評(píng)估(pn )實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的效果共三十五頁(yè)數(shù)據(jù)分析方法(fngf)標(biāo)準(zhǔn)曲線法 2CT法 要使CT計(jì)算方法有效，目標(biāo)序列和內(nèi)參(ni cn)序列的擴(kuò)增效率必須相等?？磧蓚€(gè)反應(yīng)是否具有相同的擴(kuò)增效率的方法是看他們模板濃度梯度稀釋后擴(kuò)增產(chǎn)物CT如何變化。y = -3.3168x +

11、 24.989R2 = 0.992共三十五頁(yè)Quantitative Real-time PCR技術(shù)(jsh)的應(yīng)用 Quantitative Real-time PCR 技術(shù)廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床疾病診斷、疾病研究及藥物開發(fā)等領(lǐng)域。在臨床醫(yī)學(xué)上應(yīng)用很多，發(fā)揮(fhu)重要的作用，包括在病毒檢測(cè)診斷方面的應(yīng)用、在遺傳性疾病診斷方面的應(yīng)用、在腫瘤診斷方面的應(yīng)用等。 在分子生物學(xué)方面的應(yīng)用主要是：1、基因表達(dá)的研究2、基因突變及多態(tài)性研究3、轉(zhuǎn)基因研究（DNA或RNA的定量檢測(cè)）共三十五頁(yè)1、基因表達(dá)(biod)的研究 在基因表達(dá)的研究(ynji)中，常用的方法有 Northern 印跡，R

12、T-PCR 定量法等，而 Quantitative Real-time PCR 比 Northern 印跡、RT-PCR 定量法要方便、快速、準(zhǔn)確的多。Quantitative Real-time PCR能檢測(cè)各種組織細(xì)胞中 基因的表達(dá)豐度，從而分析基因的表達(dá)調(diào)控、監(jiān)控 mRNA 表達(dá)模式、檢測(cè)組織中少量存在的基因、跟蹤細(xì) 胞群體中克隆、定量分析基因在不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平 等。 共三十五頁(yè)2、基因突變(j yn t bin)及多態(tài)性研究 擴(kuò)增 DNA 的核苷酸序列(xli)不需要分子克隆、宿主細(xì)胞 內(nèi)的生長(zhǎng)準(zhǔn)備，即可在媒介中的生物分子純化過程中直接測(cè)得，因此 Quantitative Real

13、-time PCR 可用于檢測(cè)特異突變基因。利用Quantitative Real-time PCR 和有關(guān) 的間接測(cè)序方法，可對(duì)已知 DNA 序列進(jìn)行基因突變及多 態(tài)性的分析。如對(duì)已知 DNA 序列進(jìn)行位置突變基因及序 列多態(tài)性的定位，擴(kuò)增 DNA 限制性位點(diǎn)檢測(cè)遺傳變異 等。共三十五頁(yè)3、轉(zhuǎn)基因研究(ynji) 有研究者用 Quantitative Real-time PCR 檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因水稻的外源基因拷貝數(shù)，定量(dngling)分析的外源基因拷貝數(shù)與用 southern-blot 分析結(jié)果基本一致，甚至優(yōu)于 southern-blot 分析，因?yàn)镾orthem-blot 方法在同一個(gè)位點(diǎn)有多拷貝的 T-DNA 片段插入時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株的基因組在完全酶切時(shí)會(huì)產(chǎn)生相似的DNA 片段，電泳分析時(shí)很難分析清楚。定量(dngling) PCR 則完全避免了這種情況的發(fā)生，除非目的基因 DNA 片段在 PCR 引物處發(fā)生斷裂。共三十五頁(yè)Thank You !共三十五頁(yè)內(nèi)容摘要實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)。報(bào)告信號(hào)的