啤酒酵母鯊烯合酶基因的克隆及其基因表達(dá)載體的構(gòu)建

1、啤酒酵母鯊烯合酶基因的克隆及其基因表達(dá)載體的構(gòu)建作者：馮麗玲，盧文婕，曾慶平【摘要】【目的】克隆啤酒酵母鯊烯合酶基因及構(gòu)建其基因表達(dá)載體，為在微生物體內(nèi)重建青蒿素合成途徑打下基礎(chǔ)?！痉椒ā坎捎镁酆厦告湻磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增、擴(kuò)增片段與T載體連接和克隆片段的序列分析;酶切并回收目的基因，反向插入酵母表達(dá)載體pGAPZA，雙酶切鑒定重組子?！窘Y(jié)果】通過PCR擴(kuò)增獲得1335bp片段，克隆后經(jīng)PCR和酶切反應(yīng)進(jìn)行了鑒定。初步測序結(jié)果與GenBank上已登錄的酵母鯊烯合酶基因序列基本吻合，相差僅數(shù)個(gè)堿基對;將此片段反向插入酵母表達(dá)載體pGAPZA，構(gòu)建了反義酵母表達(dá)載體，并通過雙酶切加以鑒定?！窘Y(jié)論】成功

2、克隆了啤酒酵母鯊烯合酶基因并進(jìn)行了測序，同時(shí)構(gòu)建了反義酵母表達(dá)載體?！娟P(guān)鍵詞】啤酒酵母;鯊烯合酶基因;基因復(fù)制;反義酵母表達(dá)載體青蒿素是我國自主研發(fā)的抗瘧原蟲中藥有效單體，對多藥抗性瘧原蟲有效，現(xiàn)已成為全球抗瘧藥的希望。若將青蒿素生物合成途徑從青蒿“搬到”酵母中，就能在發(fā)酵罐內(nèi)實(shí)現(xiàn)青蒿素的工業(yè)化生產(chǎn)。為了探索在酵母內(nèi)導(dǎo)入鯊烯合酶基因反義序列抑制鯊烯合酶基因表達(dá)而使青蒿素合成增加的可能性，本研究克隆了酵母鯊烯合酶基因，并經(jīng)測序予以證實(shí)，同時(shí)構(gòu)建反義酵母表達(dá)載體，為下一步培育青蒿素生產(chǎn)酵母菌打下了基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)道如下。1材料與方法11菌種啤酒酵母為INVSc1菌株購自Invitrogen公司;大腸桿菌

3、JM109由本實(shí)驗(yàn)室保存。12質(zhì)粒酵母表達(dá)載體pGAPZA購自Invitrogen公司;pMD18T載體購自Takara公司。13主要試劑與儀器酵母基因組DNA提取試劑盒(離心柱法)、質(zhì)粒DNA純化試劑盒(ConcertRapidPlasmidMiniprepSystem)、DNA片段回收試劑盒(ConcertRapidGelExtractionSystem)均購自O(shè)mega公司;聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增試劑盒(OneShotLAPCRMix)均購自Takara公司;GL20G型高速冷凍離心機(jī)(上海);5332Mastercyclerpersonal型PCR儀(德國);BGsubMINI迷你

4、型水平電泳儀(北京);MiniSpin5452個(gè)人型高速離心機(jī)(德國);260010Microcooler型制冷儀(美國)。14DNA的提取取5107酵母細(xì)胞加入600L山梨醇緩沖液和50ULyticase，充分混勻，30處理30min，4000r/min離心10min;棄上清液，收集沉淀，加入200L裂解液重懸沉淀;加入20L蛋白酶K，振蕩混勻;加入220L緩沖液并充分混勻后，置于70水浴15min;等溶液變清亮，12000r/min離心數(shù)秒;加入220L的無水乙醇，劇烈振蕩混勻數(shù)秒，此時(shí)會出現(xiàn)絮狀沉淀;將離心柱裝在收集管上，然后將所得溶液及沉淀都轉(zhuǎn)移入離心柱中;12000r/min離心1m

5、in，倒掉收集管中的濾液;加入500L蛋白清洗液，12000r/min離心1min;倒掉收集管中的濾液;并將離心柱放回收集管中;加入500L洗滌液，12000r/min離心30s;倒掉收集管中的濾液，并將離心柱放回收集管中;重復(fù)前一步驟操作1次;12000r/min離心1min，去掉離心柱中的所有液體;將離心柱放在一個(gè)干凈的、新的15mL離心管中，置于37烘箱放置510min，待管中的乙醇全部揮發(fā)為止;往離心柱中央懸空滴加經(jīng)70水浴預(yù)熱的100200L洗脫液;室溫放置2min后，12000r/min離心30s，洗脫DNA到離心管中;為了得到更多的DNA，再加100200L洗脫液，室溫放置2mi