大鼠50%減體積肝移植技術的改進

1、PAGE PAGE 7 大鼠50%減體積肝移植技術的改進何勇1,2 姜驪1,2 魚達1,2 謝海洋1,2 鄭樹森1,2（1， 浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院 衛(wèi)生部多器官聯(lián)合移植研究重點實驗室2， 浙江省器官移植重點研究實驗室 ， 杭州 310003 ）【摘要】目的 建立改良的大鼠50%減體積原位肝移植的模型。方法 在經典的雙袖套法大鼠肝移植模型的基礎上，通過4次貫通穿刺、3次結扎、2次回折的肝臟縫扎方法，改善肝臟減體積切取的效果。結果 所有50%減體積原位肝移植的大鼠均存活良好，肝功能迅速恢復正常，達到實驗設計對動物模型的要求。結論 采用本實驗室規(guī)范的4貫通、3結扎、2回折的肝臟縫扎方法，可以建

2、立穩(wěn)定的50%大鼠同種異體減體積原位肝臟移植模型，值得推廣應用?！娟P鍵詞】大鼠；減體積肝移植；動物模型The process optimization 0f 50% reduced-size liver transplantation in ratsYong He1,2, Li Jiang1,2, Da Yu1,2, Haiyang Xie1,2, Shusen Zheng1,21, Key Laboratory of Multi-Organ Transplantation, Ministry of Health；First Affiliated Hospital, Zhejiang Univ

3、ersity School of Medicine, Hangzhou 310003, China.2, Key Laboratory of Organ Transplantation in Zhejiang province, Hangzhou 310003, China.【Abstract】 Objective To investigate the methodological improvement and process optimization of 50% reduced-size liver orthotopic transplantation model in rats.Met

4、hods Base on the classical double-bushing model, establish new process to improve the effect of liver resection, with the method of penetrated puncture 4 rounds, ligate 3 times and 2 folds back to graft the 50% reduced-size donor liver orthotopically. Results All rats remain good conditions after op

5、eration, liver function keep back to normal level quickly. Conclusions With the surgical novel graft method, a stable 50% reduced-size orthotopic liver transplantation model could be established，it meet the requirement of design of experiment of animal model，and is worth promoting.【Key words】 Rat; R

6、educed-size liver transplantation; Animal model 基金項目“浙江省重點科技創(chuàng)新團隊”項目（NO.2009R50038）作者簡介何勇（1984 ），男，主要研究方向：小動物器官移植。E-mail: 通訊作者魚達（1946 ），男，主要研究方向：器官移植，實驗動物。E-mail: dayu46在對大鼠肝臟再生的研究1中，減體積的處理技術規(guī)范是十分重要的。 在研究的過程中，實驗動物技術，是研究課題重要的直接參與和組成部分。大鼠全肝移植，在一些肝臟移植著作2,3和實驗動物的論文4,5 中已有論述。在50%大鼠肝臟移植的操作技術上，不同的課題研究人員，可以采

7、用不同的方法。不同方法的技術優(yōu)缺點不易評價，本文推薦我們的方法，認為值得應用推廣。 1 材料和方法1.1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠80 只，81O周齡，體重200220g，由浙江省實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK(浙)2008-0033。本研究進行了40對大鼠的同種異體原位50減體積肝移植手術。其中， 40只用于提供50體積的供肝，40只為受體大鼠。每對供、受體大鼠體重相差15g，一般取供體大鼠的體重略小于受體?？傮w研究中1、3、5、7天分為4個實驗組，每組（group）分為2小組（part1，part2），動物分2批購置，每小組有50%減體積肝移植大鼠5只，由同一操作者，分2個階

8、段完成，見表1 。1.2 術前準備和麻醉動物飼養(yǎng)于清潔級動物實驗室，新到的大鼠在動物實驗室飼養(yǎng)3天以上。供體術前不禁食水，受體術前禁食12h，不禁水。麻醉： 供、受體均采用4%的水合氯醛0.6-0.7 ml/100g 腹腔注射麻醉。在麻醉前15 min，每只大鼠肌肉注射阿托品0.04 mg。1.3 供體手術供體大鼠麻醉、脫毛、常規(guī)消毒，取正中切口。游離、切斷肝周圍韌帶，縫扎左膈下靜脈；剪開尾狀葉前方腹膜，游離尾狀葉。距左、右肝管匯合處以下5 mm處切開膽總管前壁，插入膽管支架約2 mm結扎固定后切斷膽總管遠端。游離肝下下腔靜脈和右腎靜脈，并結扎。供肝50%減體積（將在下一節(jié)中介紹）后肝素化，再

9、在腹主動脈穿刺置管，對肝臟進行灌注，分離結扎切斷幽門靜脈、脾靜脈和胃十二指腸靜脈,縫扎肝固有動脈，遠肝端切斷，供肝取下，置于04生理鹽水浴中。1.4 供肝的處理1.4.1 供肝的50%減體積本研究通過多次的預實驗，采用 4次貫通穿刺、3次結扎和2回折的肝臟縫扎方法。具體為：整個縫扎過程使用帶針的6-0 Prolene縫線，從操作者的右側向左側依次進行。在需要切除的肝葉的右側1/3處從肝臟的臟面向膈面進針，貫通肝臟（1貫通）從右側繞至進針點處打結（1結扎），保留縫線；向右側折回（1回折），在第1針結扎肝的中間從膈面向臟面進針貫通肝臟（2貫通），再從另一面的臟面的左側1/3處進針，貫通肝臟（3貫通

10、）與保留的縫線打結（2結扎）；向右側折回（2回折），在第2針結扎肝的中間從膈面向臟面進針，貫通肝臟（4貫通）與保留的縫線在肝左側膈面打結（3結扎）。其中，每次結扎都要收緊，但要避免縫線將肝組織切斷，確實使結扎縫線環(huán)繞、阻斷肝組織中的血管。本肝臟縫扎方法簡稱：4貫通、3結扎、2回折法，見示意圖1、圖2。由于做多環(huán)繞扣式縫扎，保留肝臟周邊的變形皺折較少，見圖3、圖4。1.4.2供肝血管修整及套袖和支架的安裝套袖自制，制作規(guī)格同Kamada，門靜脈套管外徑2.20 mm，內徑1.80 mm，肝下下腔靜脈套袖外徑2.80 mm，內徑2.50 mm自制袖管做成。所有修整安裝過程均在冷生理鹽水浴中操作。大

11、鼠50%供肝的門靜脈和下腔靜脈套袖安裝和膽管支架安置方法與全肝移植相同，見圖5 。1.5 受體手術受體自身肝臟切除與供體基本相同。完全游離右腎靜脈水平以上的肝下下腔靜脈，無損傷止血夾于右腎靜脈上阻斷肝下下腔靜脈和斷門靜脈主干遠端，此時受體鼠進入無肝期。經門靜脈左右分支分叉處注入生理鹽水2ml,用無損傷止血鉗連同部分膈肌一起鉗夾肝上下腔靜脈，切除受體鼠自身的肝臟。將供肝從冷生理鹽水浴中取出，原位置入受體腹腔。供肝外包裹4鹽水紗布，擺正供肝的位置，用預置8-0縫線連續(xù)端端縫合肝上下腔靜脈。在最后一針收口前用生理鹽水沖洗管腔排盡氣體。吻合管口沖洗排氣將門靜脈袖套插入受體門靜脈腔內，環(huán)扎固定。松開門靜

12、脈和肝上下腔靜脈的阻斷鉗，結束無肝期?？梢姼闻K迅速充盈并恢復正常顏色。同法連接肝下下腔靜脈。將供肝的膽道支架管插入受體的膽總管內固定后，外用大網膜包繞。所有管道吻合連接完畢后，可見位于受體大鼠的腹腔內的50%肝臟體積明顯小于全肝，圖6 。1.6 術后處理術后大鼠置于鼠籠內，單籠飼養(yǎng)，以普通照明燈提升動物體表溫度，以便術后盡快復溫，直至大鼠活動自如。動物蘇醒后立即提供飲水和飼料，一般術后2小時起恢復飲水，6小時左右可恢復自主進食。1.7 結果的表達 本文的結果從技術技能的角度，主要采用圖解和解說；對肝功能數(shù)據(jù)，采用統(tǒng)計學中的平均值和標準差的方法6表達。2 結果本實驗每個實驗組分為2小組，分2個階

13、段，由同一操作者完成50%減體積原位肝移植。大鼠減體積肝移植與全肝移植相比較，在手術所花費的時間上有10分鐘的延長，供肝的肝臟套袖、受體肝臟吻合等步驟沒有不同。研究的結果的全部內容已有發(fā)表1?，F(xiàn)將谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）和膽紅素（TBIL）的資料顯示如下，見表1。在術后1-7天內，50%肝臟移植后的大鼠肝功能ALT、AST明顯下降，向對照組的數(shù)值靠近，TBIL值與對照組逐漸相同。大鼠50%肝臟移植完成，植入肝色澤良好，結果見圖3 。表1 手術組和對照組谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）和膽紅素（TBIL）比較*Tab. 1 The data of ALT，AST an

14、d TBIL compared with the time by surgery and control group肝功能Liver function實驗天數(shù) 組Days group ALT ( U/L )AST( U/L)TBIL( mol/L)(對照)(control)50%移植50% livergraft (對照)(control) 50%移植50% livergraft(對照)(control)50%移植50% livergraft1 daygrouppart 1(66.86.7)345.8 76.9(133.888.7)579.2118.1(3.601.14)3.830.98part

15、 2371.5100.4590.4120.93.830.763 daygrouppart 168.014.2165.243.13.671.63part 2105.278.3199.2142.83.671.515 daygrouppart 181.69.7149.264.13.601.52part 280.239.7170.884.03.801.107 daygroupgroup 186.69.6155.624.83.601.14part 292.69.0180.231.63.600.55* 結果采用統(tǒng)計學的均數(shù)和平均差的方法進行歸納。隨著術后天數(shù)的延長，50%肝臟移植大鼠的ALT、AST明顯下

16、降，向對照的數(shù)值靠近，TBIL值與對照組逐漸相同。* The results are summarized by the method of statistics of the mean and the mean difference. During the period of postoperative day, 50% of liver transplantation in the rat of ALT and AST decreased obviously to the same level of controlled group gradually; TBIL value is as

17、the same as the control group. 3 討論國內夏穗生教授的研究團隊對大鼠減體積肝移植有很好的研究2。其中他們的肝左側葉的結扎切除方法是：看清肝中葉靜脈和左側葉肝靜脈的匯合處，在其外側洞穿左側葉根部，帶入2根1-0絲線，分別向左側葉上下兩緣結扎，再剪下左側葉。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，減體積肝移植組近期并發(fā)癥和主要死亡原因是肝臟切割面出血。同時發(fā)現(xiàn)，在肝臟結扎的時候最好是保持留用肝周邊的自然張力，縫線不宜收得太緊。本研究采用相對較細的縫線，做多環(huán)繞扣式縫扎，將結扎的力分散，在肝葉切除后保留肝的變形較少。在一些預實驗的基礎上形成了我們的“4貫通、3結扎、2回折的肝臟縫扎方法”

18、。減體積肝移植手術由于手術過程中肝臟結扎邊緣肝細胞的損傷，加之缺氧和肝臟缺血再灌損傷，必然不同程度地導致肝臟轉氨酶類的釋放，所以在肝細胞數(shù)量較少的情況下，最大限度地盡快恢復肝細胞功能是有益的選擇。本方法對于從全肝移植技術熟練的人員轉向50%肝臟移植，可能產生的出血、膽道并發(fā)癥等技術問題不多，谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）在術后3天開始迅速恢復，表明本研究使用的肝臟縫扎方法有動物恢復快的優(yōu)點。這一技術在本單位對胸腺素T3加速肝臟再生1和促進肝臟缺血性損傷的恢復的研究中得到了應用7。由于正常SD大鼠的ALT、AST和TBIL的正常范圍，在有關的實驗動物書籍和論文中尚無參考值，本文主實驗

19、1需要觀察指標的設計時間較短，經對有關統(tǒng)計學6的學習，從統(tǒng)計學的“整體架構”中，認為用數(shù)據(jù)表格描述法，表達ALT、AST和TBIL比較合適。50%大鼠肝臟移植的生化指標，即便是同一操作者，由于動物的批次不同，以及實驗外環(huán)境的細微差別等，也會產生一定的差異。不同的技術操作，由于操作人員的不同，是本文所提的“方法的技術優(yōu)缺點不易評價”的原因。就本實驗室而言，該方法已成為我們大鼠減體積肝臟移植的技術規(guī)范，認為值得應用推廣。 圖1 肝臟左外葉縫扎示意圖 圖2 肝臟左中葉縫扎示意圖Fig.1 Diagram of left liver lobe suture Fig.2 Diagram of liver

20、 left middle lobe suture 圖3 去除尾狀葉和左外葉后的供肝 圖4 去除尾狀葉、左外葉和左中葉后的供肝Fig.3 The liver after removal of Fig.4 The liver after removal of caudatecaudate lobe and left lobe lobe , left lobe and the left middle lobe 圖5 供肝的套袖和支架安裝完畢 圖6 移植完成Fig.5 Cuff and stand Installed Fig.6 50% liver transplantion completed 參考文獻：1 Ahmed Taki-Eidin，Lin Zhou，Hai-yang Xie，et alTri-iodothyronine enhances liver regeneration after living donor liver transplantation in ratsJJ Hepatobiliary ancrea