06第六章-疫苗制造基本程序

1、06第六章-疫苗制造基本程序一、細菌性滅活疫苗制造 細菌性滅活疫苗簡稱滅活菌苗，種類、苗型甚多，但制造的基本程序差別不大。 （一）菌種與種子 1.菌種 制苗用菌種多數(shù)為毒力強、免疫原性優(yōu)良的菌株，通常使用1-3個品系，均由中國獸藥監(jiān)察所傳代、鑒定、凍干保存和供應。 各種用于制造菌苗的菌種應按規(guī)定定期復壯，并進行形態(tài)、培養(yǎng)特性、菌型、抗原性和免疫原性鑒定，合格菌種準許用于制苗。 2.種子培養(yǎng) 將經(jīng)鑒定符合標準的菌種接種于菌苗生產(chǎn)規(guī)程中所規(guī)定的培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng)，經(jīng)純粹檢查、活菌計數(shù)達到標準后即為種子液，用于菌苗生產(chǎn)。 種子液通常保存于2-8C冷暗處，不得超過規(guī)程規(guī)定的使用期限。 （二）菌液培養(yǎng)

2、大量生產(chǎn)的細菌培養(yǎng)方法甚多，既有手工式的，也有機械化或自動化的培養(yǎng)方式。 機械化或自動化的培養(yǎng)方式通稱為反應缸培養(yǎng)法，可供選擇的菌液培養(yǎng)法有：液體靜置培養(yǎng)法、液體深層通氣培養(yǎng)法、透析培養(yǎng)法及連續(xù)培養(yǎng)法等。 菌液培養(yǎng)也可采用固體培養(yǎng)法，該方法易獲得高濃度的細菌懸液，易稀釋成不同濃度，且含培養(yǎng)基的成分較少，所以比較適用于制備診斷用的抗原。 （三）滅 活 滅活菌苗通常根據(jù)細菌的特性加入最有效的滅活劑，采取最適當?shù)臏缁顥l件進行，幾種滅活菌苗的滅活方法如表6-1所示。 菌 苗菌或毒素滅 活 方 法豬丹毒氫氧化鋁菌苗豬丹毒桿菌菌液加入甲醛至0.2%-0.5%，37C殺菌18-24h。氣腫疽甲醛菌苗氣腫疽梭

3、菌菌液加甲醛至0.5%，37-38C殺菌72-96h。破傷風類毒素破傷風梭菌菌液上清加甲醛至0.4%，37-38C脫毒21-30d。肉毒梭菌C型菌苗（菌體毒素苗）C型肉毒梭菌菌液加加入甲醛至0.8%，37C殺菌脫毒18d。表6-1 幾種滅活菌苗的滅活方法 （四）濃 縮 為提高某些滅活菌苗的免疫力，在培養(yǎng)過程中采取提高菌數(shù)的基礎(chǔ)上，再通過濃縮方法達到目的。 常用的濃縮方法：氧化鋁膠吸附沉淀法 離心沉降法 羧甲基纖維沉淀法 以上方法可使菌液濃縮一倍以上。 此外，有些細菌在生長過程中產(chǎn)生分子量小的可溶性抗原（如豬丹毒桿菌產(chǎn)生的糖蛋白）也可經(jīng)氫氧化鋁吸附濃縮；將破傷風脫毒液按鹽酸食鹽法處理，以作進一步

4、精制成提純破傷風類毒素。 （五）配苗與分裝 由于滅活菌苗所用的佐劑不同，所以配苗方法也不相同。 豬肺疫氫氧化鋁菌苗：可在加入甲醛滅活的同時，按比例加入氫氧化鋁膠配制；也可在菌液經(jīng)甲醛滅活后再按比例加入氫氧化鋁膠配苗。 有的廠家禽霍亂油佐劑菌苗的配制程序為：于滅菌的油乳劑135m110號白油、 11.4m1Span-85、3.6ml Tween80混合液中，在邊攪拌下加入等量甲醛滅活菌液配制。 配苗和分裝：應充分混勻，及時塞塞、貼簽或印字。 二、細菌性活疫苗制造 弱毒菌種多系凍干品，由中國獸藥監(jiān)察所傳代、鑒定、保存與分發(fā)，少數(shù)由國家指定單位鑒定、保存與供給。 菌種使用前應按規(guī)程規(guī)定進行復壯、挑選

5、，并作形態(tài)、特性、抗原性和免疫原性鑒定，符合標準后方可用于制苗。 將檢定合格的菌種接種子于規(guī)定的培養(yǎng)基，按規(guī)定的條件增殖培養(yǎng)，經(jīng)純粹檢查及有關(guān)的檢查合格者即可作為種子液。種子液通常在04C可保存2個月，在保存期內(nèi)可作為菌苗生產(chǎn)的批量種子使用。 細菌性活疫苗多指弱毒菌苗，盡管種類與苗型甚多，但基本制造程序相同。（一）菌種與種子 按1%3%量將種子液接種于培養(yǎng)基，然后依不同菌苗要求進行培養(yǎng)。如豬丹毒弱毒菌須在在深層通氣培養(yǎng)中加入適當植物油作消泡劑，通入過濾除菌的熱空氣進行培養(yǎng)制造菌液；又加布氏桿菌豬2號與羊5號弱毒菌經(jīng)固體表面培養(yǎng)完成后須按規(guī)定要求將菌苔洗下制成菌液。 菌液于04C暗處保存，待抽樣

6、經(jīng)純粹、活菌數(shù)等檢查合格后使用。（二）菌液培養(yǎng) 為提高某些弱毒菌苗的免疫效果，可進行濃縮，以提高單位活菌數(shù)，常用的依縮方法有吸附劑吸附沉降法、離心沉降法等，如于豬丹毒菌液內(nèi)加入0.2% 0.25%羧甲基纖維素(CMC)進行濃縮，也可用離心沉淀濃縮。濃縮菌液應抽樣作純粹、活菌數(shù)等檢查。（三）濃縮 經(jīng)檢驗合格的菌液，按規(guī)定比例加入保護劑配苗，充分搖勻后隨即進行分裝，分裝量必須準確。 分裝好的菌苗迅速送入凍干柜進行預凍、真空干燥，凍于完畢后立即加塞、抽空、封口，移入冷庫保存，并由質(zhì)檢部門抽樣檢驗。 （四）配苗與凍干流程圖1細菌疫苗和類毒素制造工藝流程蛋白質(zhì)、肉浸液等原料培養(yǎng)基細菌分離菌 種弱毒菌種配

7、置、滅菌鑒定減毒濾過脫毒純化加吸附劑吸附檢驗配制滅菌檢驗檢驗配制滅菌原 料佐 劑滅活菌液配苗、乳化滅活疫苗培 養(yǎng)菌苗原液配 苗活疫苗保護劑類毒素毒 素純化類毒素菌 液分裝、凍干分 裝滅活原 料精制類毒素活化種子三、病毒性動物組織疫苗制造 病毒在易感動物體內(nèi)可大量增殖，但在各器官組織、部位中增殖病毒的量卻有很大的差異，利用病毒增殖迅速、含毒量高的組織制造的疫苗稱為組織疫苗(tissue vaccine)。 動物組織疫苗包括動物組織滅活疫苗和動物組織弱毒活苗兩類，前者多數(shù)由強毒株制造，如豬瘟結(jié)晶紫疫苗、狂犬病羊腦組織疫苗；后者均以弱毒株生產(chǎn)，如豬瘟兔化弱毒乳兔組織疫苗、牛瘟兔化弱毒組織疫苗等。 動

8、物質(zhì)量直接影響到組織疫苗的質(zhì)量，特別是對疫苗的安全性和效力有著決定性的作用，動物必須符合下列標準： (1)應該是清潔級(二級)以上的等級實驗動物，即無規(guī)定的人獸共患性病原體動物； (2)應是對所接種病毒易感性高的動物，即在品種、年齡和體重方面合乎要求的實驗動物。 （一）動物選擇 種毒既可用抗原性優(yōu)良、致死力強的自然毒株臟器組織毒或強毒株增殖培養(yǎng)物，也可用弱毒株組織毒種。無論何種種毒都須經(jīng)純粹、抗原性和免疫原性檢查合格后使用。 接種途徑依病毒性質(zhì)和目的而異，例如豬瘟結(jié)晶紫苗，采取豬肌肉注射血液毒種；牛瘟兔化弱毒疫苗，以兔耳靜脈注射脾淋毒種；狂犬病疫苗，用兔腦毒種接種綿羊腦內(nèi)途徑感染。 幾種動物常

9、用的接種途徑如下： 1. 腦內(nèi)注射：顱前后中線5mm平行線與瞳孔橫線交叉處。 2. 靜脈注射：家兔由耳靜脈注入；雞自翅下肢靜脈注入。 3. 肌肉注射：選擇腿部、胸部、臀部等肌肉豐滿處注射。 4. 皮下注射：家兔和豚鼠可選擇在腹部或后腿內(nèi)注射。 5. 腹腔注射：家兔與豚鼠可選腹股溝處刺入腹腔。 （二）種毒與接種 動物在接種感染后應每天觀察和檢查規(guī)定的各項指標，指標或項目因不同病毒而異。常規(guī)觀察、檢查的項目如食欲、精神和活動狀態(tài)、體溫、糞便、尿和血液變化等。 根據(jù)觀察的征象和檢查的結(jié)果選出符合要求的發(fā)病動物按規(guī)定方式剖殺，采取收集含毒量高的器官組織。如豬瘟結(jié)晶紫疫苗采取發(fā)病豬的血液制備；兔出血癥組

10、織滅活疫苗采集病兔肝臟生產(chǎn)；狂犬病疫苗利用發(fā)病羊的羊腦組織制造。（三）觀察與收獲1組織滅活疫苗 采取收獲的組織經(jīng)無菌檢驗及毒價測定合格后，按規(guī)定比例加入平衡液和滅活劑（甲醛、酚、結(jié)晶紫等）制成勻漿，然后按不同病毒的滅活溫度、時間進行滅活。如狂犬病疫苗配制按腦組織1:4加入含有甘油及1%酚蒸餾水，于360.5C滅活7天制成；豬瘟結(jié)晶紫疫苗配制，按血毒4份，結(jié)晶紫甘油溶液1份混合，于37C38C滅活68天。2. 弱毒組織疫苗 在無菌操作下剔除臟器上的脂肪與結(jié)締組織等，稱重后剪碎，加入適最保護劑制成勻漿，然后濾過扣除殘渣量，再按濾液中的實際組織量計算稀釋倍數(shù)，加入余量保護劑和青鏈霉素5001000U

11、(g/ml)，充分搖勻后置04C冷暗處處理一定時間后作無菌檢驗與毒價測定。合格者進行分裝，冷凍真空干燥制成凍干疫苗。 （四）制 苗流程圖2病毒性組織疫苗制造工藝流程動 物感染動物毒 株種 毒滅活病毒液鑒定培育檢驗檢驗配制原 料佐 劑配苗、乳化滅活疫苗含病毒組織含病毒懸液配 苗活疫苗保護劑分裝、凍干分 裝滅活原 料種 子擴增收獲配制純化病毒懸液接種四、病毒性禽胚培養(yǎng)疫苗制造 受精卵必須來自SPF雞群，至少源于未用抗生素藥物的非免疫雞群，以免受母源抗體的干擾和殘留抗生素的影響。 從受精卵入孵開始至培養(yǎng)全過程都應保持無菌，要求一定的溫度和濕度，且需不斷翻動，然后選擇。選擇一定日齡、發(fā)育正常的胚用于接

12、毒培養(yǎng)，58日齡胚適用于卵黃囊接種；911日齡胚用于尿囊腔接種；1012日齡胚適于羊膜腔接種；1112日齡胚用于絨毛尿囊膜接種。 痘病毒、正粘病毒、副粘病毒和皰疹病毒等一類生物制品，目前仍然利用禽胚特別是雞胚制備，如雞新城疫苗、鴨瘟雞胚化弱毒疫苗、犬瘟熱雞胚弱毒疫苗等。 禽胚疫苗生產(chǎn)的原材料來源方便、質(zhì)量比較容易控制，制造程序簡單，不需要過高的設(shè)備條件，生產(chǎn)的疫苗質(zhì)量可靠。（一）雞胚選擇（二）種毒與毒種繼代 目前適應于雞胚的種毒多系弱毒，包括自然弱毒與人工培育的弱毒兩類。各種制苗用的種毒多數(shù)由國家菌毒種保藏部門或指定單位保存，保存的種毒多為凍干毒。 凍干毒種需按規(guī)定要求在雞胚繼代復壯，通常繼代

13、3代以上，經(jīng)檢定符合標準后方可作力生產(chǎn)疫苗的毒種，毒種檢定內(nèi)容包括無菌檢驗、毒價測定和其他項目的檢定等。 （三）接毒與收獲 雞胚接毒涉及接毒途徑和接毒量兩方面。根據(jù)不同的病毒與不同疫苗生產(chǎn)程序，選擇最佳接種途徑和接種量。 接種途徑：絨毛尿囊膜接種 尿囊腔接種 羊膜腔接種 卵黃囊接種 如雞新城疫I系和II系毒采取尿囊腔接毒，前者接種103稀釋毒種0.1ml，后者接種104稀釋毒種0.1ml。鴨瘟雞胚化弱毒疫苗采用絨毛尿囊膜接種50-100倍稀釋毒0.2ml。1.接毒 雞胚接毒后培養(yǎng)增殖的時間和溫度、濕度以及收獲的標準與內(nèi)容物依不同的病毒和不同的疫苗而異。 如雞新城疫I系疫苗，接毒后于38.539

14、C、相對濕度60%70%條件培養(yǎng)增殖，收集接毒后2448h內(nèi)死亡胚，置010C冷卻424h，收獲胚液，進行無菌檢驗，供制備濕苗用。 也可收獲胚液、胎兒及絨毛尿囊膜混合制成乳劑制備凍干苗。 鴨瘟雞胚化弱毒疫苗，則收集接毒后48120h內(nèi)死亡的雞胚，冷卻后采取絨毛尿囊膜、尿囊液、胎兒制造凍干苗用。 2.培養(yǎng)收獲 按規(guī)定收獲的胚液、胎兒和絨毛尿囊膜乳劑經(jīng)無菌檢驗合格后即可進行配苗。 1.濕苗 通常于雞胚液內(nèi)，按每毫升加入青霉素和鏈霉素5001000U，放置010C 冷暗處處理后分裝。 2.凍干苗 經(jīng)無菌檢驗后合格的胚液或胚液、胎兒、絨毛尿囊膜乳劑，按比例加入保護劑，充分混合后濾過，于濾液內(nèi)按每毫升加

15、入青、鏈霉素5001000U，混合后分裝凍干。 3.滅活苗 收獲雞胚液經(jīng)無菌檢驗及毒價測定合格后，按規(guī)定比例加入平衡液，按不同病毒的滅活溫度、時間進行滅活，加入相應的佐劑，制備成滅活疫苗，放置4-10C保存。（四）配 苗流程圖2病毒性組織疫苗制造工藝流程受精卵禽 胚毒 株種 毒滅活病毒液鑒定培育檢驗檢驗配制原 料佐 劑配苗、乳化滅活疫苗含病毒尿囊液或禽胚組織含病毒懸液配 苗活疫苗保護劑分裝、凍干分 裝滅活原 料種 子擴增收獲配制純化病毒懸液接種五、病毒性細胞培養(yǎng)疫苗制造 用于制苗用的種毒應經(jīng)毒力、最小免疫量、安全性、無菌檢定合格，通常為凍干品，由國家指定的苗毒種保藏部門檢定分發(fā)。 領(lǐng)取的種毒應

16、按規(guī)定在細胞繼代培養(yǎng)適應后用作毒種，制苗用毒種應按規(guī)定控制在一定代數(shù)以內(nèi)，或為濕毒毒種，或為凍干毒種。 細胞培養(yǎng)疫苗有細胞培養(yǎng)滅活疫苗和細胞培養(yǎng)活疫苗兩類，前者多以強毒毒株培養(yǎng)增殖制造，后者則用弱毒毒株增殖生產(chǎn)，兩者的制造程序既有相同之處，又有區(qū)別。由于病毒不同與疫苗性質(zhì)不同，所采用的細胞及細胞培養(yǎng)方法也有所不同（一）種毒與毒種繼代 1907年美國生物學家Harrison，在無菌條件下以淋巴液為培養(yǎng)基成功地在試管中培養(yǎng)了蛙胚神經(jīng)組織達數(shù)周，創(chuàng)立了體外組織培養(yǎng)法。在隨后的近一個世紀里，隨著細胞生物學、培養(yǎng)系統(tǒng)及培養(yǎng)方法等領(lǐng)城的不斷豐富和完善，動物細胞培養(yǎng)技術(shù)得到了很大的發(fā)展。 發(fā)展至今已成為生物

17、、醫(yī)學研究和應用中廣泛采用的技術(shù)方法，利用動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價值的酶、生長因子、疫苗和單抗等，已成為醫(yī)藥生物高技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要部分。大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)在生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化進程中顯示出強大的潛力。 (二)細胞培養(yǎng)技術(shù)動物細胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展細胞培養(yǎng)技術(shù)的主要優(yōu)點 研究的條件可以人為的控制 研究的對象簡單 研究的樣本較均一性 研究的內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄 研究的范圍比較廣泛 研究的費用相對較經(jīng)濟 細胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)取出組織、細胞在體外模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無菌、適當溫度和一定的營養(yǎng)條件下，使之生存和生長，并維持其結(jié)構(gòu)和功能特性。動物細胞培養(yǎng)條件滲透壓水的質(zhì)量營養(yǎng)條件氣體條件溫度條件酸堿度無菌條件

18、細胞培養(yǎng) 目前合成培養(yǎng)基的種類已有數(shù)十種，大多數(shù)培養(yǎng)基都是為適應某種組織細胞的生長而在某種合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上改良而來的。 目前較為常用的有199培養(yǎng)液、Eagle (MEM、DMEM)培養(yǎng)液、RPMI1640培養(yǎng)液、HAM培養(yǎng)液等。 合成培養(yǎng)基的主要成份有：氨基酸、維生素、碳水化合物、 無機鹽，其它輔助物質(zhì)。基礎(chǔ)成分添加成分血清、抗生素、碳酸氫鈉、緩沖劑等(二)培養(yǎng)基生長液和維持液(三)細胞 原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即為細胞系,由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細胞世系所組成。如果不能繼續(xù)傳代，或傳代次數(shù)有限,可稱為有限細胞系(finite cell line)， 如可以連續(xù)培養(yǎng)50代以上，則稱為連

19、續(xù)細胞系(continious cell line)。1. 原代細胞 取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長的細胞在傳代之前稱為原代細胞。傳代細胞： 細胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)獲得的細胞。原代細胞的獲取： 用直接從機體獲得的細胞進行的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)，這種培養(yǎng)過程主要是采用無菌操作的方法，把組織（或器官）從動物體內(nèi)取出，經(jīng)酶消化處理，使分散成單個細胞，然后在人工條件下培養(yǎng)，使其不斷地生長和繁殖。原代細胞的培養(yǎng)和傳代： 原代細胞初代培養(yǎng)后，可以傳代，但代數(shù)有限，細胞特性有一定的變化。原代培養(yǎng)是建立各種細胞系的第一步。 傳代細胞是指能在體外連續(xù)培養(yǎng)的細胞或細胞系，

20、大都數(shù)來源于癌變細胞。 傳代培養(yǎng)是指細胞從一個培養(yǎng)瓶以1:2或其他比率轉(zhuǎn)移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。貼壁培養(yǎng)細胞的傳代通常是采用胰蛋白酶消化，把細胞分散成單細胞再傳代，而懸浮型生長細胞則用直接傳代法或離心法傳代。 2.傳代細胞及培養(yǎng) 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)與實驗室培養(yǎng)相比，培養(yǎng)條件更嚴格，控制難度更大，其培養(yǎng)方法可概括為：靜止培養(yǎng)法懸浮培養(yǎng)法 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法細胞培養(yǎng)方法固定化培養(yǎng)法 單層貼壁培養(yǎng)法 接種后，細胞經(jīng)過吸附、接觸而貼附于基質(zhì)表面，然后進行生長、分裂繁殖，很快進入對數(shù)期。一般數(shù)天就長滿整個表面，形成致密的單層細胞。 最后，貼壁培養(yǎng)的細胞會形成二種形態(tài)，成纖維樣型細胞(fibroblast-l

21、ike cell type)和上皮樣型細胞(epithilium-like cell type)。 單層貼壁培養(yǎng)(monolayer anchoraged-dependent culture)是指把細胞貼附于一定的固體支持表面上進行的單層培養(yǎng)方法，這是是動物細胞培養(yǎng)的一種重要方法。 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)是較期培養(yǎng)采用的細胞培養(yǎng)方法，目前仍用于疫苗等生產(chǎn)。 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)主要優(yōu)點是：旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)簡單，投資少，經(jīng)濟，可做成支架，大量培養(yǎng)，收獲細胞或培養(yǎng)液方便，重復性好，容易放大。表面積增加，處于衡態(tài)轉(zhuǎn)動，增加氣體交換。旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)（轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)） 懸浮培養(yǎng)（Suspension culture）是指細胞在反應器內(nèi)游離懸浮生長的

22、培養(yǎng)過程，主要對于非貼壁依賴性細胞，如雜交瘤細胞等。 動物細胞懸浮培養(yǎng)是在微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，經(jīng)常借鑒發(fā)酵理論和經(jīng)驗，但有自身的特點，由于動物細胞沒有細胞壁，不能耐受劇烈的攪拌和通氣剪切，對環(huán)境適應性差，在懸浮培養(yǎng)中要注意發(fā)揮動物細胞的特性。 常用的反應器有通氣式攪拌混合氣升式生物反應器。方法的優(yōu)點是操作簡單，培養(yǎng)條件相對均一，傳質(zhì)和傳氧較好，容易放大培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)法固定化培養(yǎng)法 固定化培養(yǎng)（immobilization culture）是將動物細胞附著微載體或包埋膠囊內(nèi)，即細胞固定化后，進行懸浮培養(yǎng)。適宜于貼壁依賴性和非貼壁依賴性細胞的培養(yǎng)。具有細胞密度高、提高了抗剪切力和污染能力等優(yōu)點，是生產(chǎn)首選方法。 吸附法(adsorption method)是通過物理吸附使細胞貼附在固體載體表面的一種固定化方法，如微載體培養(yǎng)和中空纖維培養(yǎng)等。雖然吸附法的操作過程簡單，但由于相互作用弱，細胞容易從載體上脫落。 包埋法(entrapment method)是將細胞包埋在載體內(nèi)部的