新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病

1、生物信息學(xué)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第1頁(yè)第十三章 新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 李霞、肖云、智慧生物信息學(xué)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第2頁(yè)學(xué)習(xí)提要 重點(diǎn) 新一代測(cè)序技術(shù)基本概念與基本數(shù)據(jù)分析流程RNA-seq數(shù)據(jù)分析流程ChIP-seq數(shù)據(jù)分析流程基于新一代測(cè)序技術(shù)復(fù)雜疾病分析新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第3頁(yè) 難點(diǎn) 新一代測(cè)序技術(shù)數(shù)據(jù)分析流程極其應(yīng)用Methylation-seq、CLIP-seq與Ribosome-seq 熟悉新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第4頁(yè)第一節(jié) 引言（Introduction）新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第5頁(yè)、第一代測(cè)序技術(shù)1977 雙脫氧鏈終止法 （Chain Ter

2、mination Method）1980 諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)dNTP 、ddNTP新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第6頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第7頁(yè)二、新一代測(cè)序技術(shù)快速發(fā)展MR Stratton et al. Nature 458, 719-724 （） doi:10.1038/nature07943新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第8頁(yè)第二節(jié) 新一代測(cè)序技術(shù)概述（Introduction of Next-generation Sequencing Technique）新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第9頁(yè)一、新一代測(cè)序技術(shù)基本概念（一）讀段、重測(cè)序與從頭測(cè)序?qū)DNA打壞形成小片斷DNA文庫(kù)，這些小片斷DNA能夠在百

3、萬(wàn)次平行反應(yīng)中被一致且準(zhǔn)確測(cè)序。新識(shí)別出堿基串，被稱為讀段（read）。使用一個(gè)已知參考基因組作為支架將這些讀段進(jìn)行重新組合，這個(gè)過(guò)程被稱為重測(cè)序（resequencing）。在參考基因組缺失情況下將讀段進(jìn)行組合，這個(gè)過(guò)程被稱為從頭測(cè)序（de novo sequencing）。 新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第10頁(yè)（二）測(cè)序分辨率、覆蓋度與測(cè)序深度覆蓋度，又稱為測(cè)序深度（depth），普通定義為比對(duì)到樣本DNA中單個(gè)堿基測(cè)序讀段數(shù)量均值。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第11頁(yè)二、新一代測(cè)序技術(shù)常見(jiàn)測(cè)序儀及工作流程最近市面上出現(xiàn)了很多新一代測(cè)序儀產(chǎn)品：美國(guó)Roche Applied Science企業(yè)45

4、4基因組測(cè)序儀美國(guó)Illumina企業(yè)和英國(guó)Solexa technology企業(yè)合作開(kāi)發(fā)Illumina測(cè)序儀美國(guó)Applied Biosystems企業(yè)SOLiD測(cè)序儀Dover/Harvard企業(yè)Polonator測(cè)序儀以及美國(guó)Helicos企業(yè)HeliScope單分子測(cè)序儀新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第12頁(yè)有這些新型測(cè)序儀都使用了一個(gè)新測(cè)序策略：循環(huán)芯片測(cè)序法（cyclic-array sequencing），也可將其稱為“新一代測(cè)序技術(shù)或者第二代測(cè)序技術(shù)”。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第13頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第14頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第15頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第16頁(yè)新

5、一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第17頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第18頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第19頁(yè)工作流程（Roche）產(chǎn)生單鏈模板DNA文庫(kù)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行em-PCR擴(kuò)增邊合成邊測(cè)序利用生物信息學(xué)工具分析數(shù)據(jù)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第20頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第21頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第22頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第23頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第24頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第25頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第26頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第27頁(yè)emPCR 和橋式PCR示意圖新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第28頁(yè)三、新一代測(cè)序數(shù)據(jù)存放、處理與分析新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第29頁(yè)（一）新一代測(cè)

6、序數(shù)據(jù)格式與質(zhì)量編碼伴隨新一代測(cè)序儀產(chǎn)品不停成熟，在臨床及科研工作中應(yīng)用范圍越來(lái)越廣，它們測(cè)序質(zhì)量也就變得主要起來(lái)，而且我們也需要對(duì)各個(gè)測(cè)序儀測(cè)序質(zhì)量有一個(gè)清楚、可靠評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第30頁(yè)（二）測(cè)序短片段在參考基因組中定位新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第31頁(yè)（三）新一代測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI最近專門為短片段序列建立了數(shù)據(jù)庫(kù)Short Read Archive（SRA），并同時(shí)制訂數(shù)據(jù)提交格式。SRA數(shù)據(jù)庫(kù)不但會(huì)搜集包含試驗(yàn)注釋信息、試驗(yàn)參數(shù)等信息數(shù)據(jù)，而且還會(huì)被整合到Entrez查詢系統(tǒng)當(dāng)中。當(dāng)前工作主要包含開(kāi)發(fā)線上搜索工具、數(shù)據(jù)圖形化工具。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第32頁(yè)Sequ

7、ence read Archive （SRA）新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第33頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第34頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第35頁(yè)依據(jù)SRA數(shù)據(jù)產(chǎn)生特點(diǎn)，將SRA數(shù)據(jù)分為四類：study研究課題experiment試驗(yàn)設(shè)計(jì)run測(cè)序結(jié)果集sample樣品信息新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第36頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第37頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第38頁(yè)點(diǎn)擊 Run、Sample、Experiment、Study 能夠進(jìn)行相關(guān)內(nèi)容檢索新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第39頁(yè)ERP or SRP for Studies, SRS for samples, SRX for Experiments

8、, and SRR for Runs新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第40頁(yè)層次關(guān)系新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第41頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第42頁(yè)The Run BrowserDisplay sequencing and instrumentation data on a given runRun accession No.:SRR新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第43頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第44頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第45頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第46頁(yè)Filtering and Selectionyou can filter and subset reads according to cert

9、ain regular expression pattern matching:Sequence substring: ATTGGA,ATTGGA,ATTGGA$,ATGDNNAT,ATGGA&GCGCName of a spot you are looking forEXWA4RL02G9Z6H新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第47頁(yè)Name of a spot plus a window in pixels around it.EXWA4RL02G9Z6H X=100 Y=100- will returnall spots located within 200 pixels （in X and Y

10、） from a given spot.新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第48頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第49頁(yè)Downloading Data from the Run Browser新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第50頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第51頁(yè)Using SRA DataSRA toolkit新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第52頁(yè)四、新一代測(cè)序短片段比對(duì)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第53頁(yè) 第三節(jié) DNA測(cè)序技術(shù)及應(yīng)用新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第54頁(yè)外顯子組是指全部外顯子區(qū)域集合，該區(qū)域包含合成蛋白質(zhì)所需要主要信息，涵蓋了與個(gè)體表型相關(guān)大部分功效性變異。外顯子組序列捕捉及第二代測(cè)序是一個(gè)新型基因組分析技術(shù)

11、。與全基因組重測(cè)序相比，外顯子組測(cè)序只需針對(duì)外顯子區(qū)域DNA即可，覆蓋度更深、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性更高，愈加簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、高效?？捎糜趯ふ覐?fù)雜疾病如癌癥、糖尿病、肥胖癥致病基因和易感基因等研究。一、全基因組測(cè)序與外顯子組測(cè)序新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第55頁(yè)二、DNA測(cè)序數(shù)據(jù)分析方法（一）數(shù)據(jù)質(zhì)量控制：FastQC新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第56頁(yè)Agood Illumina datasetVS Apoor Illumina dataset新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第57頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第58頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第59頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第60頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第61頁(yè)（二）片段比

12、對(duì)：Bowtie截止到當(dāng)前，研究人員已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了各種比對(duì)程序及軟件對(duì)數(shù)以百萬(wàn)記短讀段進(jìn)行有效比對(duì)：Bowtie/Bowtie2BWAMAQ等下面以Bowtie為例，舉例說(shuō)明短序列比正確過(guò)程：新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第62頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第63頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第64頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第65頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第66頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第67頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第68頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第69頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第70頁(yè)生殖細(xì)胞突變召回體細(xì)胞突變召回拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）識(shí)別SV識(shí)別（三）變異識(shí)別：

13、SNP、INDEL、CNV、SV新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第71頁(yè)（四）數(shù)據(jù)可視化：IGV新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第72頁(yè)三、DNA測(cè)序應(yīng)用（一）DNA重測(cè)序與個(gè)體變異發(fā)覺(jué)（二）細(xì)菌基因組測(cè)序與致病位點(diǎn)發(fā)覺(jué)（三）宏基因組測(cè)序與感染性疾病分析新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第73頁(yè)De novo測(cè)序即不借助任何參考序列信息對(duì)某物種進(jìn)行測(cè)序，然后用生物信息學(xué)分析方法對(duì)測(cè)出序列進(jìn)行拼接、組裝，從而取得該物種基因組序列圖譜?？蓱?yīng)用于細(xì)菌、真菌、動(dòng)物和植物等基因組測(cè)序宏基因組測(cè)序新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第74頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第75頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第76頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第77頁(yè)新一代測(cè)

14、序技術(shù)與復(fù)雜疾病第78頁(yè)metagenomicmetagenomes,geneticmaterial recovered directly fromenvironmentalsamplesAssemblyGene predictionSpecies diversityComparative metagenomics新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第79頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第80頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第81頁(yè)怎樣利用重測(cè)序進(jìn)行SNP分析？（1） 測(cè)序結(jié)果預(yù)處理，去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)；（2） 利用短序列比對(duì)軟件進(jìn)行全基因組比對(duì)，找出多態(tài)性位點(diǎn)；新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第82頁(yè)（3） 依據(jù)一定規(guī)則來(lái)篩選

15、可靠SNP位點(diǎn)，這些規(guī)則會(huì)因?yàn)椴灰粯有枨笥兴灰粯?，如MAQ中要求：SNP位點(diǎn)附近3bp內(nèi)沒(méi)有另外SNP；SNPs覆蓋度要大于3；SNP必須有質(zhì)量分?jǐn)?shù)60序列覆蓋；在任意連續(xù)10bp中不超出3個(gè)SNP； （4） 為了更直觀地查看SNP位點(diǎn)信息，能夠使用一些可視化軟件進(jìn)行畫(huà)圖。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第83頁(yè)SNP 可視化新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第84頁(yè)基因拷貝數(shù)變異：copy number variations CNV是指較之于參考基因組, DNA片段缺失或復(fù)制大于1 kb至Mb結(jié)構(gòu)變異主要包含：缺失（deletions）、嵌入（insertions）、復(fù)制（duplications）和復(fù)合多

16、位點(diǎn)變異（complex multisite variants）統(tǒng)稱為拷貝數(shù)變異（copy number variations, CNVs）或拷貝數(shù)多態(tài)（copy number polymor-phisms, CNPs）。CNVs本身蘊(yùn)涵著豐富遺傳信息新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第85頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第86頁(yè)High Throughput DNA Sequencing based Methods to detect CNVs新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第87頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第88頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第89頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第90頁(yè)Rare variants低頻或者稀有

17、SNP（即MAF0.05SNP）稀有SNP位點(diǎn)不但占有總SNP絕對(duì)大多數(shù)，而且占有含有非同義突變（或有害突變）SNP大部分rare is common新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第91頁(yè)四、DNA測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于復(fù)雜疾病案例全外顯子組測(cè)序研究乳腺癌易感基因新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第92頁(yè) 第四節(jié) RNA測(cè)序技術(shù)與數(shù)據(jù)分析新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第93頁(yè)、RNA測(cè)序技術(shù)流程（一）RNA樣本準(zhǔn)備（二）cDNA測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建（三）高通量測(cè)序新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第94頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第95頁(yè)二、RNA-seq 數(shù)據(jù)分析（一）RNA-seq數(shù)據(jù)比對(duì)reads起源于剪接后轉(zhuǎn)錄組序列，但因?yàn)閰⒖嫁D(zhuǎn)錄組

18、信息不完善，當(dāng)前研究通常是將reads比對(duì)到參考基因組，而不是參考轉(zhuǎn)錄組。這種現(xiàn)象可能造成一些位于剪接區(qū)域reads比對(duì)不準(zhǔn)確。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第96頁(yè)因?yàn)闇y(cè)序錯(cuò)誤引發(fā)堿基插入、缺失、錯(cuò)配等現(xiàn)象使得reads比對(duì)更為復(fù)雜，影響比對(duì)結(jié)果準(zhǔn)確性。在序列比對(duì)過(guò)程中，一個(gè)read可能比對(duì)到基因組多個(gè)位置。 新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第97頁(yè)慣用比對(duì)軟件新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第98頁(yè)（二）轉(zhuǎn)錄組重建基因組引導(dǎo)法（genome-guided）基因組獨(dú)立法（genome-independent）新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第99頁(yè)慣用裝配軟件新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第100頁(yè)（三）轉(zhuǎn)錄本表示定量RPKM

19、 （reads per kilo bases of transcript for per million mapped reads）FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads）新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第101頁(yè)（四）RNA-seq差異表示分析統(tǒng)計(jì)基因或轉(zhuǎn)錄本對(duì)應(yīng)reads計(jì)數(shù)；對(duì)reads計(jì)數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，使樣本間和樣本內(nèi)表示水平能夠進(jìn)行準(zhǔn)確比較；對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化后reads分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)模型擬合，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)評(píng)定基因差異表示，得到對(duì)應(yīng)P值和差異倍數(shù)（fold change），并完成多重檢驗(yàn)校正；依據(jù)特定閾值（比

20、如FDR0.05）提取顯著差異表示基因。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第102頁(yè)差異表示分析軟件新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第103頁(yè)三、RNA-seq應(yīng)用1.基本概念選擇性剪接又稱可變剪接，是調(diào)整真核生物基因功效多樣性主要機(jī)制之一?？勺兗艚邮侵竚RNA前體中外顯子以不一樣組合方式進(jìn)行剪切和拼接，從而產(chǎn)生不一樣結(jié)構(gòu)、不一樣功效mRNA和蛋白質(zhì)。（一）選擇性剪接識(shí)別新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第104頁(yè)同一基因產(chǎn)生不一樣結(jié)構(gòu)mRNA和蛋白質(zhì)也被稱作可變剪接異構(gòu)體?？勺兗艚臃绞街饕?種類型：外顯子盒、外顯子互斥、可變5供體、可變3受體和內(nèi)含子保留?？勺兗艚訌V泛存在于人類細(xì)胞中，極大地豐富了mRNA和蛋白質(zhì)種

21、類和功效。 新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第105頁(yè)2.RNA-seq識(shí)別可變剪接單末端和雙末端RNA-seq測(cè)序均可用于檢測(cè)可變剪切事件，但原理略有不一樣新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第106頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第107頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第108頁(yè)當(dāng)前慣用基于RNA-seq識(shí)別可變剪接軟件，TopHat工作流程：新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第109頁(yè)步驟1.reads基因組比對(duì)2.預(yù)測(cè)潛在外顯子3.預(yù)測(cè)可能剪切方式4.匹配識(shí)別剪接位點(diǎn)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第110頁(yè)reads基因組比對(duì)利用Bowtie將全部reads比對(duì)到參考基因組，并分為匹配reads和未匹配reads。其中，未匹配rea

22、ds稱為初始未匹配reads（initially unmapped reads，IUM reads）。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第111頁(yè)預(yù)測(cè)潛在外顯子利用MAQ重新將匹配reads比對(duì)到參考基因組，得到reads富集基因組區(qū)域，這些區(qū)域被稱為島序列（island sequence），即潛在外顯子。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第112頁(yè)預(yù)測(cè)可能剪切方式TopHat將島序列兩端各延長(zhǎng)一定距離側(cè)翼序列（默認(rèn)為45bp）以包含供體位點(diǎn)和受體位點(diǎn)。供體位點(diǎn)和受體位點(diǎn)分別指內(nèi)含子5末端剪接位點(diǎn)和3末端剪接位點(diǎn)。TopHat遍歷全部延長(zhǎng)后島序列供體和受體位點(diǎn)，并進(jìn)行鄰近島序列間兩兩組合，使其能夠形成經(jīng)典GTAG

23、結(jié)構(gòu)，這些組合被認(rèn)為是候選剪接方式。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第113頁(yè)識(shí)別剪接位點(diǎn)對(duì)于每種候選剪接方式，TopHat利用“種子延長(zhǎng)”策略確定是否存在IUM reads覆蓋潛在剪接位點(diǎn)。最終，TopHat返回全部滿足條件剪接位點(diǎn)和組合方式。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第114頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第115頁(yè)（二）應(yīng)用舉例Shapiro等人利用乳腺上皮細(xì)胞系建立了體外上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化模型，并對(duì)模型組樣本和對(duì)照組樣本分別進(jìn)行了RNA-seq測(cè)序。他們將read匹配到人類參考基因組hg18，并經(jīng)過(guò)Acembly基因注釋工具確定每個(gè)外顯子邊界和剪切位點(diǎn)。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第116頁(yè)隨即，結(jié)合AceVi

24、ew數(shù)據(jù)庫(kù)提供轉(zhuǎn)錄本注釋信息識(shí)別了兩組樣本中可能可變剪切事件和307個(gè)EMT相關(guān)可變外顯子（可能被剪接外顯子）。表示相關(guān)性分析表明這些外顯子能夠準(zhǔn)確地域分腔內(nèi)型和基底型兩種亞型。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第117頁(yè)1.基本概念融合基因是指染色體重排過(guò)程中兩個(gè)或多個(gè)不一樣基因編碼區(qū)首尾相連，并被同一套調(diào)控序列（如開(kāi)啟子、增強(qiáng)子等）控制所組成嵌合基因。融合基因能夠編碼異常融合蛋白，從而參加疾病發(fā)生。（二）復(fù)雜疾病中融合基因識(shí)別新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第118頁(yè)2.RNA-seq識(shí)別融合基因全基因組測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是主要兩種用于融合基因識(shí)別技術(shù)。因?yàn)閃GS技術(shù)含有顯著缺點(diǎn)測(cè)序耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)、分析復(fù)雜、價(jià)格昂

25、貴。所以，當(dāng)前大多數(shù)研究都是基于RNA-seq數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)識(shí)別融合基因算法，這些算法主要分為兩種：先匹配、先組裝。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第119頁(yè)先匹配算法首先將reads匹配到參考基因組，然后從比對(duì)結(jié)果中尋找融合位點(diǎn)從而識(shí)別融合基因。而先組裝算法則首先將有重合reads組裝形成長(zhǎng)序列片段，然后將這些長(zhǎng)序列片段匹配回參考基因組，進(jìn)而識(shí)別融合基因事件。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第120頁(yè)先匹配算法相比于先組裝算法運(yùn)行速度更加快、計(jì)算更方便。所以，先匹配算法使用更為廣泛。分離reads同時(shí)適合用于單末端和雙末端測(cè)序，而跨越對(duì)只適合用于雙末端測(cè)序。以先匹配算法為例，融合基因識(shí)別主要經(jīng)過(guò)三個(gè)步驟：1）匹配

26、和過(guò)濾；2）融合位點(diǎn)檢測(cè)；3）融合基因組裝和選擇。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第121頁(yè)雙末端RNA-seq測(cè)序識(shí)別融合基因流程新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第122頁(yè)匹配和過(guò)濾經(jīng)過(guò)將RNA-seq產(chǎn)生reads匹配到參考基因組，過(guò)濾全部成功匹配reads或者一致匹配reads對(duì)，找出潛在分離reads或者跨越對(duì)。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第123頁(yè)融合位點(diǎn)檢測(cè)對(duì)于基于分離reads算法，首先將每一個(gè)read分割成多個(gè)小片段，再分別把這些小片段獨(dú)立地匹配到參考基因組。假如該read首尾兩端小片段分別比對(duì)到不一樣染色體或基因上，那么推測(cè)這個(gè)read來(lái)自融合基因，進(jìn)而經(jīng)過(guò)校正原始片段邊界定位融合位點(diǎn)。而對(duì)于基

27、于跨越正確算法，首先將全部跨越對(duì)進(jìn)行聚簇，每一簇覆蓋一個(gè)潛在融合位點(diǎn)，然后經(jīng)過(guò)簇中reads對(duì)融合位點(diǎn)進(jìn)行定位。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第124頁(yè)融合基因組裝和選擇經(jīng)過(guò)拼接融合位點(diǎn)兩側(cè)基因序列，形成候選融合轉(zhuǎn)錄本。然后將全部分離reads重新比對(duì)到候選融合轉(zhuǎn)錄本，進(jìn)而基于成功匹配分離read計(jì)數(shù)，選擇高置信融合轉(zhuǎn)錄本作為預(yù)測(cè)融合基因。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第125頁(yè)（三）應(yīng)用舉例少數(shù)融合基因事件已經(jīng)被研究發(fā)覺(jué)在特定癌癥中頻繁發(fā)生。近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)推進(jìn)了融合基因研究，借此研究人員發(fā)覺(jué)了一些新含有臨床診療和預(yù)后價(jià)值融合基因事件。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第126頁(yè)Delattre等人利用SO

28、LiD 平臺(tái)對(duì)4例骨肉瘤樣本進(jìn)行了RNA-seq雙末端測(cè)序，將產(chǎn)生read對(duì)比對(duì)到參考基因組，并同時(shí)利用三個(gè)分析軟件（如FusionSeq）識(shí)別新融合基因。經(jīng)過(guò)分析基因外顯子read覆蓋度，他們發(fā)覺(jué)在其中一個(gè)患者測(cè)序數(shù)據(jù)中，有20個(gè)read對(duì)橫跨X染色體上BCOR基因15號(hào)外顯子和CCNB3基因5號(hào)外顯子，從而推斷存在BCOR-CCNB3融合基因。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第127頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第128頁(yè)為了深入預(yù)計(jì)BCOR-CCNB3在骨肉瘤患者群體中發(fā)生頻率，作者對(duì)594例骨肉瘤患者進(jìn)行融合特異RT-PCR檢測(cè)，發(fā)覺(jué)其中24例患者攜帶BCOR-CCNB3。基于基因表示無(wú)監(jiān)督多元分

29、析結(jié)果顯示，骨肉瘤可能存在一個(gè)以融合基因BCOR-CCNB3為標(biāo)志新亞型。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第129頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第130頁(yè)（四）非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本識(shí)別與發(fā)覺(jué)使用Cufflinks和Scripture進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組裝配;篩選表示轉(zhuǎn)錄本，即要求轉(zhuǎn)錄本每個(gè)堿基覆蓋度大于3個(gè)reads；過(guò)濾與已知非lincRNA基因外顯子有重合轉(zhuǎn)錄本。非lincRNA基因注釋起源包含：1）RefSeq、 UCSC或GENCODE中蛋白編碼基因；2）ENSEMBL注釋microRNAs、tRNAs、snoRNAs與rRNAs；3）假基因（pseudogenes）；新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第131頁(yè)利用P

30、hyloCSF（phylogenetic codon substitution frequency）軟件評(píng)定每一個(gè)轉(zhuǎn)錄本蛋白編碼能力，過(guò)濾編碼能力得分大于100轉(zhuǎn)錄本；利用HMMER-3軟件搜索每個(gè)轉(zhuǎn)錄本全部可能編碼閱讀框，并與Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域比較，過(guò)濾含有類似蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄本；第6步篩選長(zhǎng)度超出200bp轉(zhuǎn)錄本。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第132頁(yè)lncRNA識(shí)別流程新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第133頁(yè)四、RNA-seq技術(shù)應(yīng)用于復(fù)雜疾病案例tophat -p 8 -N 2 -a 8 -m 0 -i 70 -I 500000 -library-type fr-unstranded

31、-o SRR073760 SRR073760.fastqcufflinks -p 8 -o SRR073760 -g hg19/genes.gtf accepted_hits.bamcuffcompare -r /hg19/genes.gtf -o /cufflinks/cuffcompare -i /cufflinks/cuffcompare/sapmle.txt -C利用TopHat進(jìn)行比對(duì)使用Cufflinks進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組重建使用cuffcompare進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組融合新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第134頁(yè)采取決議樹(shù)方法從構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組中區(qū)分背景和真實(shí)表示轉(zhuǎn)錄本新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第135頁(yè)106

32、個(gè)未注釋lincRNA在前列腺癌中展現(xiàn)差異表示一個(gè)新奇lincRNA PCAT-1是前列腺癌特異細(xì)胞增殖調(diào)控子新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第136頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第137頁(yè)第五節(jié) ChIP-seq技術(shù)與應(yīng)用（ChIP-seq Technique and Application）新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第138頁(yè)一、ChIP-seq技術(shù)原理染色質(zhì)免疫共沉淀-測(cè)序技術(shù)（chromatin immunoprecipitation sequencing， ChIP-seq）是染色質(zhì)免疫共沉淀與高通量測(cè)序結(jié)合技術(shù)，ChIP-seq技術(shù)是繼ChIP-chip（chromatin immunoprec

33、ipitation followed by DNA microarray）之后，研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用又一技術(shù)突破。已被廣泛地用于全基因組范圍內(nèi)測(cè)定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（非組蛋白ChIP-seq）與組蛋白修飾基因組定位（組蛋白 ChIP-seq）。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第139頁(yè)（一）ChIP-seq技術(shù)流程第1步：DNA結(jié)合蛋白和DNA發(fā)生交聯(lián)，形成蛋白質(zhì)-DNA交聯(lián)復(fù)合物。第2步：提取蛋白質(zhì)-DNA交聯(lián)復(fù)合物，將染色質(zhì)隨機(jī)打壞成小片段。第3步：添加特異抗體富集目標(biāo)蛋白。第4步：解交聯(lián)，純化DNA片段并進(jìn)行DNA片段選擇。第5步：DNA片段經(jīng)末端修復(fù)、接頭添加與PCR擴(kuò)增，完成測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建

34、并進(jìn)行測(cè)序。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第140頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第141頁(yè)二、ChIP-seq數(shù)據(jù)處理方法（一）reads比對(duì)和預(yù)處理比對(duì)考慮到測(cè)序錯(cuò)誤、SNPs、插入缺失或者感興趣基因組與參考基因組之間差異，reads比對(duì)時(shí)允許少許堿基錯(cuò)配，保留唯一匹配到參考基因組上reads。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第142頁(yè)過(guò)濾因?yàn)镻CR擴(kuò)增會(huì)產(chǎn)生冗余reads（duplicate reads，即多個(gè)reads含有相同基因組定位），所以通常使用SAMtools或Picard Tools等軟件將其去除。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第143頁(yè)延伸因?yàn)闄z測(cè)reads起源于DNA片段5端序列（25 75 bp

35、），所以，reads基因組定位并不能反應(yīng)真實(shí)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合或組蛋白修飾位點(diǎn)。所以在峰識(shí)別或信號(hào)定量及可視化之前，短序列reads需要向3方向延伸一定長(zhǎng)度，以確保延伸后reads能夠近似代表真實(shí)DNA片段。ChIP-seq數(shù)據(jù)后續(xù)分析都是基于延伸后reads進(jìn)行。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第144頁(yè)（二）峰識(shí)別及信號(hào)定量基本概念峰識(shí)別（peak calling）：利用ChIP-seq數(shù)據(jù)識(shí)別轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)或者定位組蛋白修飾富集區(qū)域；信號(hào)定量：對(duì)于給定基因組區(qū)域，定量其ChIP-seq信號(hào)強(qiáng)度。ChIP-seq數(shù)據(jù)定量慣用RPKM值，RPKM值定量方法有效地防止了測(cè)序深度對(duì)reads計(jì)數(shù)影響，能夠用

36、于不一樣信號(hào)或不一樣本之間信號(hào)強(qiáng)度比較分析。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第145頁(yè)峰識(shí)別軟件窄峰: 大部分峰識(shí)別方法都是針對(duì)該類型數(shù)據(jù)，如MACS、PeakSeq、F-seq、SISSRs和FindPeaks等； 寬峰：SICER、ZINBA、 PeakSeq和BayesPeak等；混合峰：PeakSeq 和ZINBA等。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第146頁(yè)峰類型1）窄峰（sharp peak）大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子和一些組蛋白修飾，ChIP-seq產(chǎn)生reads分布高度集中，通常聚集在幾百個(gè)堿基窄峰中（如CTCF,H3K4me3）；2）寬峰（broad peak）一些組蛋白修飾富集基因組區(qū)域是寬敞，rea

37、ds分布跨越數(shù)萬(wàn)個(gè)堿基較大區(qū)域（如H3K36me3,H3K27me3）；新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第147頁(yè)3）混合峰（mix peak）窄峰和寬峰交織出現(xiàn)，比如RNA聚合酶II（RNA polymerase II，pol II）結(jié)合位點(diǎn)。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第148頁(yè)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第149頁(yè)（三）信號(hào)可視化可視化工具UCSC基因組瀏覽器（UCSC Genome Browser）：較有影響力可視化工具之一，UCSC提供用戶自定義軌道（custom tracks），允許用戶上傳當(dāng)?shù)匚募M(jìn)行全基因組瀏覽，且支持各種數(shù)據(jù)格式。網(wǎng)址：/）新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第150頁(yè)IGV（integ

38、rative genomic viewer）：一個(gè)交互式大型綜合基因組數(shù)據(jù)集成可視化工具，也可用于高通量測(cè)序數(shù)據(jù)基因組注釋以及可視化。 網(wǎng)址：/software/igv/home新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第151頁(yè)ChIP-seq基因組瀏覽舉例ChIP-seq數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)reads比對(duì)、過(guò)濾和延伸后，在單堿基水平上定量信號(hào)強(qiáng)度，此過(guò)程由igvtools與wigToBigWig軟件完成，由BAM格式比對(duì)文件計(jì)算得到bigWig格式定量文件，并將定量信息上傳至UCSC基因組瀏覽器（圖）。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第152頁(yè)圖中轉(zhuǎn)錄因子與各種組蛋白修飾信號(hào)用不一樣顏色展現(xiàn)，每一個(gè)信號(hào)對(duì)應(yīng)一個(gè)自定義軌道，代表

39、不一樣ChIP-seq數(shù)據(jù)reads分布，reads數(shù)目越多顯示在基因組瀏覽器上信號(hào)值越高。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第153頁(yè)ChIP-seq基因組瀏覽舉例ARHGEF17基因開(kāi)啟子以及基因體區(qū)域發(fā)生了H3K27me3信號(hào)丟失，表明ARHGEF17基因在NEC中被激活新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第154頁(yè)1. CisGenome 2. ChIPseeqer 3. ChIPpeakAnno （四）ChIP-seq數(shù)據(jù)集成份析工具當(dāng)前，針對(duì)ChIP-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理、比對(duì)、峰識(shí)別以及功效刻畫(huà)集成份析工具不停涌現(xiàn)，比較慣用工含有:新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第155頁(yè)三、ChIP-seq技術(shù)應(yīng)用（一）識(shí)

40、別轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白修飾協(xié)同調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，包括到一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子及其輔因子共同結(jié)合到靶基因開(kāi)啟子區(qū)域，進(jìn)而協(xié)同地調(diào)控靶基因表示，所以基因及其眾多調(diào)控子共同形成了錯(cuò)綜復(fù)雜轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第156頁(yè)方法舉例計(jì)算每?jī)蓚€(gè)轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)強(qiáng)度皮爾森相關(guān)系數(shù)（Pearson correlation coefficient），層次聚類分析轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合模式相同性矩陣；新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第157頁(yè)ChIP-seq數(shù)據(jù)識(shí)別TFs協(xié)同調(diào)控新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第158頁(yè)（二）調(diào)控元件識(shí)別基因開(kāi)啟子: H3K4me3信號(hào)主要富集在基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近,所以H3K4me3峰能

41、夠識(shí)別基因開(kāi)啟子（舉例）;增強(qiáng)子：H3K4me1和H3K27ac信號(hào)可用于定義激活增強(qiáng)子區(qū)域；新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第159頁(yè)絕緣子：轉(zhuǎn)錄因子CTCF信號(hào)可用于定義基因組絕緣子區(qū)域；轉(zhuǎn)錄區(qū)域：H3K36me3可用于定義基因組轉(zhuǎn)錄區(qū)域。抑制區(qū)域：H3K27me3信號(hào)可用于定義基因組抑制區(qū)域。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第160頁(yè)組蛋白信號(hào)識(shí)別開(kāi)啟子新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第161頁(yè)基本概念（三）motif發(fā)覺(jué)模體：轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)通常含有特定DNA序列模式，稱為模體（motif），它是轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合主要功效域，長(zhǎng)度普通為520bp。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第162頁(yè)慣用motif搜索算法慣用

42、motif識(shí)別軟件包含字符搜索算法（word-based，string-based methods）概率序列模型搜索算法（probabilistic sequence models）MEME、HOMER和FIMO新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第163頁(yè)位置權(quán)重矩陣（position weight matrix）比如，為了識(shí)別谷氨酸受體（glucocorticoid receptor，GR）結(jié)合位點(diǎn)motif，堿基大小表示該堿基出現(xiàn)百分比。位置權(quán)重矩陣衡量ATGC四種堿基在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)上每個(gè)位置所占百分比，使用序列標(biāo)識(shí)圖（sequence logo）進(jìn)行可視化。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第164頁(yè)C

43、hIP-seq數(shù)據(jù)識(shí)別TFs結(jié)合位點(diǎn)用于motif識(shí)別新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第165頁(yè)（四）預(yù)測(cè)基因表示轉(zhuǎn)錄因子是基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中不可或缺調(diào)控子，基因開(kāi)啟子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合強(qiáng)度、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合數(shù)目與基因表示水平親密相關(guān)。組蛋白修飾是另一層面轉(zhuǎn)錄調(diào)控子。經(jīng)過(guò)評(píng)定基因表示與其開(kāi)啟子區(qū)域上組蛋白修飾信號(hào)之間相關(guān)性，發(fā)覺(jué)一些組蛋白修飾信號(hào)與基因表示呈正相關(guān)（比如H3K4me3），而另一些組蛋白修飾信號(hào)與基因表示則呈負(fù)相關(guān)（比如H3K27me3）。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第166頁(yè)所以，整合基因開(kāi)啟子區(qū)域上轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合強(qiáng)度或者各種組蛋白修飾水平，構(gòu)建機(jī)器學(xué)習(xí)模型（如線性回歸模型），實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表示水平預(yù)測(cè)。

44、新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第167頁(yè)四、ChIP-seq技術(shù)應(yīng)用于復(fù)雜疾病分析（一）轉(zhuǎn)錄因子ChIP-seq 用于指導(dǎo)臨床用藥數(shù)據(jù)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM），使用ChIP-seq技術(shù)在檢測(cè)TCF4和STAT3全基因組結(jié)合位點(diǎn)；計(jì)算結(jié)合位點(diǎn)落入各個(gè)功效元件百分比；基于二者共同靶基因區(qū)分GBM不一樣亞型；新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第168頁(yè)TCF4和STAT3結(jié)合位點(diǎn)分布及其與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤亞型分類關(guān)系新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第169頁(yè)TCF4和STAT3結(jié)合位點(diǎn)分布及其與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤亞型分類關(guān)系新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第170頁(yè)目標(biāo)探索TCF4和STAT3

45、共同調(diào)控差異靶基因與指導(dǎo)臨床用藥聯(lián)絡(luò)方法1）TCF4和STAT3共同差異表示靶基因重新將GBM聚為兩類（間質(zhì)型和前神經(jīng)型）2）依據(jù)是否接收替莫唑胺（temozolomide，TMZ）治療，將間質(zhì)型亞型和前神經(jīng)型GBM樣本分別分為兩組；3）生存分析： log-rank test檢驗(yàn)新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第171頁(yè)結(jié)果在間質(zhì)型亞型GBM樣本中發(fā)覺(jué)接收TMZ治療樣本含有更加好整體生存率；而前神經(jīng)型GBM樣本中，并沒(méi)有顯著地提升病人整體生存率。新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第172頁(yè)TCF4和STAT3協(xié)同差異靶基因指導(dǎo)臨床用藥新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第173頁(yè)TCF4和STAT3協(xié)同差異靶基因指導(dǎo)臨床用藥新一代測(cè)序技術(shù)與復(fù)雜疾病第174頁(yè)（二）組蛋白修飾ChIP-seq數(shù)據(jù)與復(fù)雜疾病擴(kuò)散型內(nèi)因性腦橋神經(jīng)膠質(zhì)瘤（diffuse intrinsic pontine glioma，DIPG）與神經(jīng)干細(xì)胞（neural