自制脂質納米泡聯(lián)合低功率超聲治療腫瘤的實驗探究

1、A Dissertation Submitted to Huazhong University ofScience and Technology for the Degree of Master of MedicineExperimental Study on Tumor Therapy by Home-made Lipid Nanobubbles combined with Low- power UltrasoundCandidate : Qian ChaoMajor:Imaging and Nuclear MedicineSupervisor : Prof. Chen YunchaoDep

2、artment of Ultrasonography, Tongji hospitalHuazhong University of Science and TechnologyWuhan, Hubei, P. R. ChinaApril, 2014獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學位論文是我個人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除文中已經標明引用的內容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經發(fā)表或撰寫過的研究成果。對本文的研究做出貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本人完全意識到，本聲明的法律結果由本人承擔。學位論文作者簽名：日期：年月日學位論文版權使用授權書本學位論文作者

3、完全了解學校有關保留、使用學位論文的規(guī)定，即：學校有權保留并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權華中科技大學可以將本學位論文的全部或部分內容編入有關數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存和匯編本學位論文。保密，在 _年解密后適用本授權書。本論文屬于不保密。（請在以上方框內打 ）學位論文作者簽名：日期：年月日指導教師簽名：日期：年月日目錄英文縮略詞1中文摘要2Abstract4論文正文引言7實驗材料9實驗方法10實驗結果14討論22結論27參考文獻28綜述31致謝44碩士在讀期間書寫的文章45華中科技大學碩士學位論文英文縮略詞英文縮寫英文全

4、稱CEUSContrast-enhancedUltrasoundPIPeak IntensityMVDMicrovesselDensityDMEMDulbecco s modified Eagle s mediumPBSPhosphate Buffered SalineDSPC DistearoylPhosphatidyl CholineDSPE-PEG 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-phosphoethanolamineROIRegion of InterestNBNanobubblem MicrometerMIMechanical Indexml Millilit

5、erdB DecibelMHzMillionhertzH-E Hematoxylin-EosinCDFIColor Doppler Flow ImagingUCA UltrasoundContrast AgentTIC Time-IntensitycurveCPSContrast Pulse SequencingHIFUHigh Intensity Focused UltrasoundIHC Immunohistochemistrynm Nanometer中文全稱超聲造影峰值強度微血管密度改良的伊格爾培養(yǎng)基磷酸緩沖液二硬脂酰磷脂酰膽堿二硬脂?；字Ｒ掖及?-聚乙二醇感興趣區(qū)納米泡微米機械指數(shù)

6、毫升分貝兆赫茲蘇木精 -伊紅彩色多普勒血流成像超聲造影劑時間 -強度曲線對比脈沖序列高強度聚焦超聲免疫組織化學納米1華中科技大學碩士學位論文自制脂質納米泡聯(lián)合低功率超聲治療腫瘤的實驗研究華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院超聲影像科碩士研究生：錢超導師：陳云超教授摘要目的研究自制脂質納米泡聯(lián)合低功率超聲對結腸癌鼠皮下移植瘤的治療效果；對比相同質量濃度的不同微泡聯(lián)合低功率超聲對腫瘤的治療效果；探討自制納米泡聯(lián)合不同功率參數(shù)的低功率超聲對腫瘤的治療效果。方法建立 44 只 Balb/C 裸小鼠皮下結腸癌移植瘤模型，隨機分成4 組：組1(n=16)作為對照組，組2(n=6) Sonovue聯(lián)合1.5w

7、/cm2 低功率超聲（Low-powerUltrasound，L-US ）治療，組 3（n=16）自制納米泡（ Nanobubble，NB ）聯(lián)合 1.5w/cm2L-US 治療，組 4（ n=6）NB 聯(lián)合 2.5w/cm2 L-US 治療。在治療前、治療后即刻、1h、24h、48h 五個時間點，對各組行超聲造影（Contrast-enhanced Ultrasound，CEUS）檢查，運用統(tǒng)計學方法比較各組間治療前后各時間點的顯影聲強度（Video Intensity ，VI ）的差異。在治療后即刻、1h、24h、72h 四個時間點，完成CEUS 后對組 1 和組 3中的 4 只處死取腫瘤

8、組織行各時間點兩組腫瘤組織切片的HE 染色、免疫組化CD31染色和治療后72h 時間點兩組腫瘤組織切片的免疫組化Ki67 染色，觀察各時間點兩組病理結果的差異；對治療后24h 時間點的兩組的CD31 染色片子進行微血管密度Microvessel Density ，MVD ）計數(shù)，對治療后 72h 時間點的兩組的 Ki67 染色片子進行 Ki67 標記計數(shù)，并運用統(tǒng)計學方法比較兩組間MVD 和 Ki67 標記計數(shù)的差異。結果與組 1 相比，組 2、組 3、組 4 在治療后即刻和治療后1h VI 都顯著降低，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P0.05）；組 4 與組 3 相比，兩者 VI 差異在治療后即刻、

9、 1h、24h 均有統(tǒng)計學意義（ P0.05）。HE染色：組 1 各時間點：腫瘤組織結構完好；組3 治療后：腫瘤細胞形態(tài)結構破壞； CD31 染色：組 1 各時間點：腫瘤組織內可見大量微血管，結構完好；組 3 治療后：微血管明顯減少，結構破壞。治療后24h，組 3 的 MVD值明顯2華中科技大學碩士學位論文低于組 1，差異有顯著統(tǒng)計學意義（ P0.01） ；治療后 72h，組 3 的 Ki67 標記計數(shù)值明顯低于組 1，差異有顯著統(tǒng)計學意義（ P0.01） 。結論自制脂質納米泡聯(lián)合低功率超聲能夠破壞腫瘤的微血管和腫瘤組織，引起細胞增殖減低， 發(fā)揮治療作用； 自制脂質納米泡聯(lián)合 1.5w/cm2

10、 低功率超聲對腫瘤血供的抑制大于相同質量濃度的微米級微泡 Sonovue聯(lián)合低功率超聲； 自制脂質納米泡聯(lián)合 2.5w/cm2 低功率超聲對腫瘤血供的抑制時間和抑制程度大于自制脂質納米泡聯(lián)合 1.5w/cm2 低功率超聲。關鍵詞納米泡低功率超聲移植瘤超聲造影微血管密度3華中科技大學碩士學位論文Experimental Study on Tumor Treatment byHome-made Lipid Nanobubbles combinedwith Low- power UltrasoundDepartment of Ultrasonography ， Tongji Hospital, To

11、ngji Medical College,Huazhong University of Science and Technology Postguaduate： Qian ChaoInstructor ： Prof.Chen YunchaoAbstractObjectiveTo investigate the effect of physical therapy in mice coloncancer xenografts by home-made nanobubbles combined with low-powerultrasound by comparing the effect of

12、different bubbles with different powerparameters.Method44 Balb/C nude mice xenograft models of colon cancerwere established and they were randomly divided into 4 groups：Group1(n=16) as a control group ， Group 2 （ n=6） were treated with Sonovue combined with Low-power Ultrasound of 1.5w/cm 2， Group 3

13、 （n=16 ）weretreated with nanobubbles(NB) combined with Low-power Ultrasound of1.5w/cm 2，Group 4 （ n=6） were treated with NB combined with Low-power Ultrasound of 2.5w/cm 2.At five time points of before， immediately ，1h，24h and 48h after4華中科技大學碩士學位論文treatment，the mice were given Contrast-enhanced ult

14、rasound（ CEUS） toobtain the tumor CEUS imaging and video intensity （ VI ）for analysis later At four time points of immediately ，1h，24h and 72h after treatment ，the mice ofgroup 1 and 3 were sacrificed immediately after CEUS for HE， CD31 andKi67 staining ， but Ki67 staining only for tumor tissue at t

15、he time point of 72hafter treatment The pathological results of the two groups at each time pointwere observed Ki67 tag count and microvessel density(MVD) count weredone for analysis.ResultsCompared with group 1 ，the VI of group 2 ，3 and 4 at thesetwo time points of immediately and 1h after treatmen

16、t was significantly low（P0.05）；At time points of immediately ，1h and 24h after treatment ， the difference of VI between group 4 and 3 was significant statistically (P0.05 ） .The results of HE staining: for the group 1 at all time points, thestructures of tumor tissue were intact；for the group 3 afte

17、r treatment, themorphology and structures of the tumor cells were destroyed. The results of CD31 staining: for the group 1 at all time points, a large number ofmicrovessles within the tumor tissue were seen， and the structures ofmicrovessles were intact ；for the group 3 after treatment, the number o

18、f microvessles was significantly reduced, and the structures of microvessles were damagedAt 24h after treatment ， the MVD count of the group 3 was significantly lower than that of group 1 （P0.01）；At 72h after treatment ，the Ki67 tag count of group 3 was significantly lower than that of the group 15華

19、中科技大學碩士學位論文（P0.01 ）Conclusion Tumor treatment can be achieved by home-made lipid nanobubbles combined with low- power ultrasound by destruction of tumor tissue and tumor microvessles.The time of tumor blood supply suppressed by NB+L-US of 1.5w/cmwas longer than Sonovue+L-US of 1.5w/cm2 in same bubbl

20、e massconcentration ；The effect of treatment on VI was was not statistically different between Sonovue+L-US of 1.5w/cm 2 and NB+L-US of 1.5w/cm 2 in samebubble mass concentration.The time of tumor blood supply suppressed by NB+L-US of 2.5w/cm was longer than NB+L-US of 1.5w/cm 2； The effect of treat

21、ment on VI by NB+L-US of 2.5w/cm 2 was significantly larger than NB+L-US of 1.5w/cm 2.22Key words:nanobubble low-power ultrasound xenograft CEUS MVD6華中科技大學碩士學位論文自制脂質納米泡聯(lián)合低功率超聲治療腫瘤的實驗研究引言腫瘤能夠生長和轉移，有賴于腫瘤的新生血管的形成。因此，想要使腫瘤缺血、缺氧、凋亡和壞死，可以通過阻斷腫瘤血管的生成，那么腫瘤生長就會受到抑制并且細胞轉移便會減少。傳統(tǒng)的介入方法治療腫瘤主要針對較大的營養(yǎng)血管，不能有效栓塞小的滋養(yǎng)

22、血管，而且對于多發(fā)、散在的腫瘤組織也難通過手術或血管介入栓塞治療；現(xiàn)有的針對腫瘤新生血管特異性靶點的生物或化學藥物不良反應較多，療效也不甚理想1 。臨床上迫切需要一種靶向阻斷腫瘤新生血管的治療方法。超聲空化效應引發(fā)的機械效應可以對組織細胞造成損傷， 加上微泡作為人為空化核的引入，降低了空化閾值，提高了空化效應。相比瘤周正常血管，腫瘤血管對空化效應的反應更敏感，因此超聲空化治療對腫瘤血管具有靶向性2 ; 已有研究表明，低頻超聲輻射超聲微泡造影劑，可損傷血管內皮3 ，從而激活內、外源性凝血途徑，使微血管內血栓形成，從而引起栓塞，腫瘤缺血壞死?？寡苌芍委熥鳛槔^放療、化療、免疫治療后新的非手術治療

23、腫瘤方法，在腫瘤治療中日益受到重視，但療效評價是亟需解決的問題。CD31 能夠標記腫瘤血管內皮細胞，通過 CD31 免疫組化染色計數(shù)MVD ，可以對腫瘤新生血管增生的程度及分布做出判斷，是臨床上和醫(yī)學實驗中評價血管生成的金標準 4 。但是這種方法僅能用于術后評價微血管密度（ Microvessel Density ，MVD ）。如何能夠術前獲得腫瘤血管新生信息，指導臨床工作，實現(xiàn)個體化治療，需要新的功能性成像方法，代替MVD 計數(shù)評價。超聲微泡造影劑多為微米級，目前中國使用的是 Sonovue，它不能通過血管壁，只能在血池中顯像，因此能顯示腫瘤實質內的微血管5 ，這就克服了傳統(tǒng)灰階超聲以及彩色

24、或能量多普勒超聲檢查存在的缺陷，因此超聲造影的出現(xiàn)提高了超聲診斷水平。但是臨床上常規(guī)超聲造影診斷用于腫瘤性病變時， 主要依靠診斷者主觀的觀察和判斷，受制于診斷者經驗的影響，有一定主觀性，如能結合定量技術，量化造影時間7華中科技大學碩士學位論文強度，超聲診斷的可重復性可大大提高6 。新的成像技術與造影分析軟件的發(fā)展，造就了超聲分子影像學時代的到來，同時對超聲造影劑提出了新的要求，比如：納米級造影劑、靶向造影劑。要想實現(xiàn)腫瘤特異性靶向顯像，超聲造影劑需要穿過腫瘤血管到達腫瘤細胞部位，但是臨床常用超聲造影劑為微米級，只能血池顯影，不能穿透血管內皮間隙，并且腫瘤血管內皮間隙雖然較正常組織血管內皮大，但

25、至多700nm，因此粒徑小、穿透力強的納米級超聲微泡造影劑，越來越受到人們的關注。本實驗所用為自制脂質納米泡（Nanobubble，NB ），前期已證實其良好的超聲造影（ Contrast-enhanced Ultrasound，CEUS）效果，并且利用自制納米泡進行了基因轉染方面的研究 7 ，本次實驗檢測其與低功率超聲（Low-power Ultrasound ， L-US）聯(lián)合用于腫瘤的抗血管治療是否有潛在的優(yōu)勢。8華中科技大學碩士學位論文實驗材料一、細胞及實驗動物：CT26 小鼠結腸癌細胞由同濟醫(yī)院肝外科實驗室惠贈；裸小鼠（ Balb/C-nu/nu）（ SPF 級） 50 只，雌性，

26、4-5 周齡，體重 18 2g（購于北京華阜康研究動物有限公司） ，飼養(yǎng)于同濟醫(yī)院動物實驗中心無特定病原體（ SPF）環(huán)境。二、實驗儀器：浴式聲振儀 (40 kHz ，100 W ，Branson)、超聲破碎儀 (SoNICS)、恒溫水浴器（金壇市城西麗華實驗儀器廠）；馬爾文激光粒度儀 (Nano-ZS90 型)、血球計數(shù)板、倒置熒光顯微鏡 (TS100， Nikon 公司 )；超聲治療儀 (Intelect 2776)；LOGIQ E9 型彩色多普勒超聲診斷儀（ GE 公司）。三、實驗試劑：DSPC(Sigma）、DSPE-PEG2000（Avanti）、C3F8 (天津核工業(yè)理化工程研究院

27、 )；胎牛血清 (Gibco) 、PBS (Gibco)、高糖 DMEM （ Hyclone）、0. 25 % 胰酶 (Gibco)； 1%戊巴比妥鈉； SonoVue 超聲造影劑 (Bracco 公司 )。9華中科技大學碩士學位論文實驗方法一、脂質納米泡制備（1）制備過程：在劉娜香 8 介紹的方法基礎上，制備步驟如下：取干凈管型瓶，將一定比例的DSPC 和 DSPE-PEG2000放于其中；加入氯仿 /乙醇，體積比為 9:1，再加入適量 PBS；為獲得脂質體，將上述混合物置于 65恒溫水浴器中蒸發(fā)，直到有機溶劑完全去除；取充滿全氟丙烷氣體5mL 無菌小瓶，加入上述脂質體懸液2 mL （脂質濃

28、度1mg/mL ），加蓋密封后再加壓注入全氟丙烷7.5 mL；浴式聲振儀中聲震上述小瓶10 min 即得脂質納米泡（ NB ），保存于 4冰箱中，需要時取用。（2）物理性質檢測：倒置顯微鏡及透射電子顯微鏡觀察微泡的形態(tài)、分散度及均勻性；馬爾文激光粒度儀測量平均粒徑和表面電位；血球計數(shù)板計算納米泡濃度。二、細胞培養(yǎng)和裸小鼠皮下結腸癌移植瘤模型的建立（1）細胞培養(yǎng)：選擇處于對數(shù)生長期的 CT26 細胞，消化細胞采用 0.25%胰蛋白酶，重懸細胞采用無血清的高糖 DMEM 培養(yǎng)基，調整活細胞濃度達 1107 個 /ml。（2）選擇裸小鼠右肩背部皮下為接種點， 接種上述細胞懸液 0.1ml/ 只，每只

29、裸小鼠皮下接種一個點。次日記為接種第 1d，待所有荷瘤鼠腫瘤長徑達 1cm 時開始進行處理。三、動物分組及處理剔除移植瘤過大或過小的裸小鼠，成功建立裸小鼠皮下移植瘤模型的44 只裸小鼠進行后續(xù)實驗。10華中科技大學碩士學位論文（1）分組： 44 只裸鼠，隨機分為4 組：組 1（對照組， n=16）、組 2（Sonovue+L-US(1.5w/cm2)，n=6）、組 3（NB+L-US(1.5w/cm2)， n=16）、組 4（ NB+L-US(2.5w/cm 2)，n=6）。（2）治療方案：組 2：將 Sonovue 按照說明配制，經檢測濃度為（ 2.0-5.0）108 個/ml ，稀釋 10

30、 倍后，每只裸小鼠經尾靜脈注入 Sonovue 0.1ml，注射后 15s 開始用脈沖式超聲探頭輻照腫瘤組織區(qū)，輸出功率 1.5w/ cm2，占空比 20%，頻率 1MHz ，輻照時間 3min；組 3：為使組 3 所用 NB 的質量濃度與組 2 所用 Sonovue 的質量濃度相同，并且每只裸小鼠經尾靜脈注入 NB 的體積也為 0.1ml ，經計算，需將提前制備好的原始泡濃度（1.6-3.2） 109 個/ml 調整到（ 0.8-1.6） 109 個/ml 。其它操作同組 2，尾靜脈注入NB 后 15s 開始用脈沖式超聲探頭直接輻照腫瘤組織區(qū)，輸出功率1.5w/cm2，占空比20%，頻率 1

31、MHz ，輻照 3min；組 4：同組 3 所用的 NB ，每只裸小鼠經尾靜脈注入NB 0.1ml ，注射后 15s 開始用脈沖式超聲探頭輻照腫瘤組織區(qū)，輸出功率2.5w/cm2，占空比 20%，頻率 1MHz ，輻照時間 3min；組 1：尾靜脈注入 0.1ml 生理鹽水，超聲探頭給予假照。四、CEUS：在治療前、治療后即刻、 1h、24h、48h五個時間點，對各組行CEUS 檢查。（1）每次實驗前裸小鼠用1的戊巴比妥納（ 0.2ml/20 g 小鼠體重）腹腔注射麻醉，使其俯臥位固定于硬紙板上。（2）先用二維超聲檢查腫瘤以選定最大直徑切面來固定采集影像。（3）LOGIQ E9 型彩色多普勒超

32、聲儀選擇選擇SMP 模式，深度調到 2cm，打開 Contrast模式，實驗過程中深度、增益、機械指數(shù)、時間增益補償（TGC）等參數(shù)保持一致。（4）尾靜脈團注 Sonovue 0.05ml，開始注射按下 “ CLOCK ”，儲動態(tài)造影視頻1min，DICOM 格式保存。（5）應用 GE Logiq E9 型彩色多普勒超聲診斷儀自帶的分析軟件分析造影視頻，以病灶整體平均強度做出時間-強度曲線，讀出每個動態(tài)造影視頻的血流灌注參數(shù)峰值強度11華中科技大學碩士學位論文（Peak Intensity，PI）。五、病理檢查：在治療后即刻、治療后1h、24h、72h 四個時間點，CEUS后分別對組 1 和組

33、 3 中的 4只裸小鼠頸椎脫位法處死，連同包膜完整剝離出腫瘤組織，以10%甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，每個腫瘤組織同一位置連續(xù)切2 張切片，治療后 72h 時間點的每個腫瘤組織同一位置連續(xù)切3 張切片。（1）HE 染色：HE 染色操作交由谷歌生物公司完成。光鏡下觀察HE 染色切片。（2）免疫組化 CD31 染色及 MVD 計數(shù)：CD31 染色操作交由谷歌生物公司完成。光鏡下觀察CD31 染色切片，并進行MVD計數(shù)。MVD 計數(shù)方法：根據(jù) Weidner9 的方法：由兩位熟悉腫瘤微血管并經驗豐富的病理醫(yī)師完成。作為記數(shù)指標的不是血管腔和腔內的紅細胞數(shù)，CD31 能把血管內皮細胞被染成棕色，因此界

34、定一個血管如下：染成棕色的細胞和細胞簇、有或無完整管腔結構。巨噬細胞和漿細胞等也可與抗體起反應，因此對識別血管內皮細胞造成干擾。先使用低倍鏡 (4)，尋找微血管密度最高的視野，后使用高倍鏡 ( 40)，計數(shù)染成棕色的微血管。為減少主觀因素造成的實驗誤差， 每人計數(shù) 3 個視野的微血管數(shù)，取兩人的平均值作為 MVD 值。（3）免疫組化 Ki67 染色及 Ki67 標記計數(shù)：Ki67 染色交由谷歌生物公司完成。 鏡下觀察免疫組織化學Ki67 染色切片，并進行 Ki67標記計數(shù)。Ki-67 標記計數(shù)方法：參照劉軍 10 的方法：細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒的是陽性細胞，每張切片隨機觀察5 個高倍鏡視野，計

35、數(shù)1000 個腫瘤細胞中的陽性標記細胞，算出百分數(shù)，然后取5 個高倍鏡下的平均值。12華中科技大學碩士學位論文六、統(tǒng)計學處理：采用 SPSS 18.0 統(tǒng)計分析軟件包。所得數(shù)值以均數(shù)標準差（x s）表示；各研究組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析。以檢驗水準=0.05， P0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。13華中科技大學碩士學位論文實驗結果一、脂質納米泡的制備（1）光鏡及透射電鏡觀察：NB 呈球形，分散均勻，未見明顯聚集（圖 1）。（2）經檢測：平均粒徑： 424.4689.32nm；平均表面電位： -（ 2.491.42）mV 。（3）血球計數(shù)板計數(shù)：制備出的NB 原始泡濃度（ 1.63.2）

36、109 個/ml 。調整到治療需用泡濃度（0.81.6） 109 個/ml 。圖 1 光鏡下稀釋后的 NB注： A ： (10) NB 分散均勻，未見明顯聚集B：( 40)NB 呈球形二、裸小鼠結腸癌CT26 皮下移植瘤模型的建立情況（圖2）50 只裸小鼠在研究過程中均成活，生活狀態(tài)無明顯改變，接種后12d，所有裸小鼠右肩背部均出現(xiàn)隆起性腫塊，選取其中44 只腫瘤長徑約1cm 左右的裸小鼠進入后續(xù)實驗。14華中科技大學碩士學位論文圖 2 裸小鼠結腸癌 CT26 細胞皮下移植瘤模型注：右肩背部可見直徑約 1cm 的皮下瘤三、CEUS結果（1）視覺判斷（圖3）治療前的各組腫瘤組織及治療后各時間點的

37、組1：超聲造影均可見均勻增強，血流灌注良好無充盈缺損，無顯著差異；治療后即刻：組2、組 3、組 4 腫瘤組織均出現(xiàn)輻照區(qū)域充盈缺損，整體幾乎無造影劑灌注，呈明顯負性顯影；治療后1h、24h：組 2、組 3、組 4 腫瘤組織超聲造影仍均可見輻照區(qū)域充盈缺損，見于腫瘤中心部；治療后48h：組 2 腫瘤組織超聲造影血流灌注基本恢復，未見明顯充盈缺損，組3 和組 4 腫瘤組織內仍可見小的不規(guī)則的充盈缺損。15華中科技大學碩士學位論文圖 3 兩種治療不同時間點的CEUS注： Sonovue+US 組（ A,B,C,D,E ）NB+US 組（ a,b,c,d,e）治療前 (A,a) 治療后即刻 (B,b)

38、 治療后 1h(C,c) 治療后 24h(D,d) 治療后 48h(E,e)（2）VI 分析VI 由 PI 減去造影劑出現(xiàn)前組織本身的聲強度值（本底強度）得到。Sonovue+L-US(1.5w/cm2)治療效果（表 1）：組 2 與組 1 的 VI 相比較：治療后即刻、 1h，組 2 的 VI 顯著低于組 1，差異有顯著統(tǒng)計學意義（ P0.05）。說明 Sonovue+L-US(1.5w/cm2) 治療后維持抑制腫瘤血供達 1h。16華中科技大學碩士學位論文治療前治療后即刻 治療后 1h治療后 24h 治療后 48h組 2 30.931.701.520.26 27.67 1.3829.050

39、.85 31.372.21組 1 30.030.9830.80 1.56 31.321.6131.021.61 31.821.53P0.05 0.01 0.05 0.05表 1組 2 與組 1 治療前后各時間點的VI 值（ ?s，db）NB+L-US(1.5w/cm 2)治療效果（表 2）：組 3 與組 1 的 VI 相比較：治療后即刻、 1h，組 3 的 VI 顯著低于組 1，差異有顯著統(tǒng)計學意義（ P0.01）；治療后 24h，組 3 的 VI 低于組 1，差異有統(tǒng)計學意義（ P0.05）。說明 NB+L-US(1.5w/cm 2)治療后維持抑制腫瘤血供達 24h。治療前治療后即刻 治療后

40、 1h治療后 24h 治療后 48h組 3 31.052.001.480.29 26.67 2.3328.130.56 30.721.99組 1 30.030.9830.80 1.56 31.321.6131.021.61 31.821.53P0.05 0.01 0.01 0.05表 2組 3 與組 1 治療前后各時間點的VI 值（ ?s，db）NB+L-US(2.5w/cm 2)治療效果（表 3）：組 4 與組 1 的 VI 相比較：治療后即刻、 1h、 24h，組 4 的 VI 顯著低于組 1，差異有顯著統(tǒng)計學意義（ P0.01）；治療后 48h，組 2 的 VI 低于組 1，差異有統(tǒng)計學

41、意義（P0.05 0.01 0.01 0.01 0.05表 3組 4 與組 1 治療前后各時間點的VI 值（ ?s，db）17華中科技大學碩士學位論文 Sonovue+L-US(1.5w/cm2)與 NB+L-US(1.5w/cm 2)比較治療效果（表4）：組 2 與組 3 的 VI 相比較：治療后即刻、 1h、24h、48h，組 2 的 VI 與組 3 相比，雖然差異均無統(tǒng)計學意義（ P0.05），但數(shù)值上可見組 3 的 VI 均低于組 2。說明自制納米泡聯(lián)合 1.5w/cm2 低功率超聲對腫瘤血供抑制水平稍強于相同質量濃度的 Sonovue聯(lián)合 1.5w/cm2 低功率超聲。?治療前治療后

42、即刻 治療后 1h治療后 24h 治療后 48h組 2 30.931.70 1.520.26 27.671.3829.050.85 31.372.21組 3 31.052.00 1.480.29 26.672.3328.130.56 30.721.99P0.05 0.05 0.05 0.05 0.05表 4組 2 與組 3 治療前后各時間點的VI 值（ ?s，db） NB+L-US(2.5w/cm 2)與 NB+L-US(1.5w/cm 2)比較治療效果（表5）：組 4 與組 3 的 VI 相比較：治療后即刻、 1h、 24h，組 4 的 VI 與組 3 相比，差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）。

43、說明自制納米泡聯(lián)合 2.5w/cm2 低功率超聲在治療后即刻、 1h、24h 對腫瘤血供抑制水平大于自制納米泡聯(lián)合 1.5w/cm2 低功率超聲。?治療前治療后即刻 治療后 1h治療后 24h 治療后 48h組 4 30.801.84 0.850.37 19.100.9620.751.70 29.431.26組 3 31.052.00 1.480.29 26.672.3328.130.56 30.721.99P0.05 0.05 0.05 0.05表 5組 4 與組 3 治療前后各時間點的VI 值（ ?s，db）四、HE 染色光鏡下觀察（圖4）：組 1 各時間點：腫瘤組織排列緊密，腫瘤細胞核大

44、深染，組織間未見紅細胞滲出；組3 治療后即刻、 1h：腫瘤細胞排列疏松，血管內皮連續(xù)性中斷，組織間有大量紅細胞滲出，并可見細胞水腫、空泡、囊性變；組3 治療后 24h、48h：中央可見淡染區(qū)，并18華中科技大學碩士學位論文可見紅細胞崩解碎片，血管結構難以識別，腫瘤組織內可見淡染區(qū)域擴大，并可見核固縮、核溶解。圖 4 組 3（NB+L-US(1.5w/cm 2)）治療后 HE 染色顯示腫瘤組織的病理變化注： A ：（ 40）顯示細胞排列疏松B：（ 10）顯示周圍水腫C：（ 4）顯示空泡、囊性變D：（ 4）顯示核固縮、核溶解五、免疫組化CD31染色及 MVD計數(shù)（1）光鏡下觀察（圖5）：組 1 各

45、時間點：腫瘤組織內可見大量微血管，管腔結構完整；組3 治療后即刻、 1h、24h：微血管密度明顯減少，微血管閉合呈線狀，腫瘤中央?yún)^(qū)的微血管結構難以識別；組 3 治療后 48h：腫瘤周邊微血管增多。19華中科技大學碩士學位論文圖 5 組 3（NB+L-US(1.5w/cm 2)）治療后 CD31 染色顯示腫瘤組織的微血管注：血管內皮細胞被染成棕色A ：( 10) 微血管密度明顯減低 , 閉合呈線狀B： (40)微血管結構不完整（2）MVD 計數(shù) (表 6)：治療后 24h，組 3 的 MVD 值明顯低于組 1，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P0.01）。組 3組 1MVD （?s， %）30.22.65

46、0.23.4P 0.01表 6 組 3（NB+L-US(1.5w/cm 2)）與組 1(對照組 )治療后 24h 的 MVD 值（? s，%）六、免疫組化Ki-67染色及 Ki-67 標記計數(shù)（1）光鏡下觀察（圖6）：治療后 72h，組 1 與組 3 瘤組織內均可見細胞核中含棕黃色顆粒的陽性細胞，但組3腫瘤組織中部的陽性細胞數(shù)明顯少于組1。20華中科技大學碩士學位論文圖 6 組 3（NB+L-US(1.5w/cm 2)）與組 1（對照組）的 Ki67 染色顯示增值細胞（40）注：圖中可見細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒的細胞為Ki67(+) 細胞A ：組 3 的腫瘤組織中陽性細胞稀少B：組 1 的腫瘤組

47、織中陽性細胞較多（2） Ki-67 標記計數(shù)（表 7）：治療后 72h，組 3 的陽性細胞數(shù)明顯低于組1，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P0.01）。組 3組 1Ki-67 標記計數(shù)（ ?s，%）37.3 4.761.23.6P 0.01表 7 組 3（NB+L-US(1.5w/cm 2)）與組 1（對照組）治療后 72h 的 Ki67 標記計數(shù)（ ?s，%）21華中科技大學碩士學位論文討論（1）腫瘤血管生成的重要性不單腫瘤的生長需要腫瘤新生血管的形成，腫瘤的轉移也離不開血管新生，因此抑制腫瘤生長減少腫瘤細胞轉移，使腫瘤缺血、缺氧、凋亡和壞死，需要阻斷腫瘤血管的生成。傳統(tǒng)的介入治療主要針對較大的營養(yǎng)血

48、管，對小的滋養(yǎng)血管不能有效栓塞，而且對于散在、多發(fā)的腫瘤組織也難通過手術或血管介入栓塞的方式得到治療；現(xiàn)有的通過藥物攻擊腫瘤新生血管特異性靶點的方法易引起許多不良反應且很難達到理想效果1 。因此臨床上迫切需要一種新的治療方法來靶向阻斷腫瘤新生血管的形成11 。（2）腫瘤血管的特點腫瘤新生血管基底膜明顯減少，缺乏血管壁神經和肌肉成分，血管內皮細胞分化程度較差，且多處于細胞增殖期，因此血管通透性明顯升高12,13 ，這是腫瘤新生血管與正常組織的成熟血管在結構和功能上的區(qū)別。（3）超聲微泡抗血管治療腫瘤的原理由于上述特點，腫瘤血管對空化效應的反應更為敏感，因此超聲空化治療對腫瘤血管更具靶向性 2 。

49、由于微泡作為人為空化核的引入14 ，治療時間縮短，空化效應增強，尤其是瞬態(tài)空化可有效破壞腫瘤血管，并且腫瘤新生血管越豐富，微泡越容易進入腫瘤內積聚，進而引起更強的空化效應。Vaezy 等 15 認為空化效應導致的是組織結構破裂，而不是使組織凝固性壞死。超聲破裂微泡抗腫瘤血管的可能原因：一方面直接損傷血管內皮細胞，啟動內、外源性凝血，導致微血管血栓形成，阻斷血供；同時，微血管周圍的水腫、血腫等反應，擠壓微血管，進一步減少靶區(qū)血供16 ；此外，組織的血流量的減少也造成熱療散熱的減少，因而提高熱療的療效。 但最后一點在低功率超聲聯(lián)合微泡治療中作用微小。本實驗病理結果可見：納米泡聯(lián)合超聲治療后，腫瘤細

50、胞排列疏松，血管內皮連續(xù)性中斷，組織間有大量紅細胞滲出，并可見細胞水腫、空泡、囊性變，隨著時間的22華中科技大學碩士學位論文推移，并可見核固縮、核溶解，腫瘤組織內可見淡染區(qū)域擴大。納米泡聯(lián)合超聲導致了腫瘤組織結構破壞和壞死。CD31 染色結果可見：相比治療前，治療后腫瘤組織微血管密度明顯減少，微血管閉合呈線狀，腫瘤中央?yún)^(qū)的微血管結構難以識別，因此納米泡聯(lián)合超聲能夠破壞腫瘤的微血管。CEUS 納米泡聯(lián)合超聲治療后即刻， VI 為（ 1.480.29） db，顯著低于對照組（ 30.801.56） db，差異有顯著統(tǒng)計學意義（ P0.01）。這與其他人的研究相一致。高文宏等 17 采用低頻超聲輻照

51、微泡，觀察其對裸鼠人肝癌HepG2 移植瘤微血管的損傷作用，肉眼可見腫瘤表面出現(xiàn)散在、多發(fā)的出血點，光鏡下可見腫瘤微血管內皮細胞腫脹、血管壁斷裂，組織間隙彌漫性出血、水腫、血腫；腫瘤組織造影的兩個血流灌注定量參數(shù)曲線下面積和峰值強度百分比均明顯下降。Liu 等18 采用低頻超聲輻照微泡治療鼠皮下移植瘤，使用聲強分別為 0.4 W/cm 2 和 1.36 W/cm2，發(fā)現(xiàn)：聲強 0.4 W/cm2 時對腫瘤組織的血管破壞程度比 1.36 W/cm2 輕；當聲強為 1.36 W/cm 2 時，可完全阻斷移植瘤的血供達 24 h，而聲強 0.4W/cm2 時，腫瘤微循環(huán)只能阻斷約1 h ；光鏡下可見

52、腫瘤組織微血管內血栓形成、組織間隙水腫、空泡形成，并可見瘤組織的大面積壞死。此外，利用超聲空化效應損傷血管壁，也在對其它多種組織的研究中得到證實16 ，19-21 。（4）納米泡聯(lián)合超聲物理治療腫瘤的優(yōu)勢前人的研究多集中于超聲聯(lián)合微米級微泡用于腫瘤的治療，如：Sonovue、脂氟顯、白蛋白微泡等，納米級微泡憑借粒徑小、穿透力強、穩(wěn)定性高22,23 等優(yōu)勢，越來越受到人們的關注，但多用于成像研究、靶向研究、載藥性研究方面24,25 ，納米級微泡聯(lián)合超聲的能否用于腫瘤物理治療以及是否也有其潛在的優(yōu)勢，正是這次研究的問題。本實驗對比相同質量濃度的微米級微泡Sonovue和自制納米級微泡在同樣超聲參數(shù)

53、下對結腸癌皮下移植瘤的抗血管治療效果。VI 由 CEUS 血流灌注參數(shù) PI 減去造影劑到來前組織本身的聲強度值得到，它反映腫瘤組織的造影增強強度，可以反映腫瘤的血流灌注情況。治療后即刻兩組分別與對照組的VI 比較， VI 均明顯下降，差異有顯著的統(tǒng)計學意義（P0.01），兩者均表現(xiàn)出良好的破壞腫瘤微血管的效果，但各時23華中科技大學碩士學位論文間點兩組間 VI 相比，差異無統(tǒng)計學意義。分析其原因如下：超聲破裂微泡通過產生機械作用 26 損傷內皮細胞， 根據(jù)物理學理論， 單個的微米級微泡其被破壞產生的機械能量大于納米級微泡， 但是同樣質量濃度的納米級微泡個數(shù)遠大于微米級微泡，另外，納米泡的穿透

54、力強，容易穿透血管壁達周圍靶細胞，在脈沖超聲作用下，不單破壞了血管中的納米泡損傷了血管壁內皮細胞，也破壞了滲出血管壁外的納米泡進而直接損傷周圍腫瘤細胞，造成的血管外反應可能相對更為嚴重。因此可能造成了兩者的損傷作用無明顯差異。另外，與對照組的VI 對比可見： Sonovue+L-US 組：治療后 24h 腫瘤組織恢復血供； NB+L-US 組：治療后48h 腫瘤組織恢復血供。相同質量濃度的納米泡聯(lián)合低頻率超聲對腫瘤血供的抑制時間長于Sonovue聯(lián)合低頻超聲治療。排除因樣本量小，統(tǒng)計學分析可能存在偏倚的原因外，產生這種結果可能的原因：納米泡的穿透力強，可穿透血管壁達周圍腫瘤細胞，在脈沖超聲作用

55、下，通過破壞滲出血管壁外的納米泡直接損傷血管外的腫瘤細胞，影響了腫瘤細胞缺血促發(fā)的各種促血管生長因子的產生。因此，納米泡聯(lián)合超聲對腫瘤物理治療時，不光直接破壞血管內皮細胞，同時直接破壞血管壁外腫瘤細胞，從長期效應來看，納米泡聯(lián)合超聲阻斷腫瘤血供持續(xù)48h，較相同腫瘤濃度的微米級微泡Sonovue抑制血供時間長。（5）CEUS定量分析參數(shù)的價值CD31 抗原廣泛分布于腫瘤毛細血管內皮細胞，可使血管內皮細胞標記，因此利用免疫組化CD31 染色能夠顯示極微小的腫瘤新生血管。評價血管生成的金標準27是 MVD 計數(shù)，它利用 CD31 來標記腫瘤血管內皮細胞，因此可反映腫瘤新生血管情況。但存在的問題是，

56、這種病理方法一般只能術后獲得，無法對放化療中或術前的腫瘤的血管生成情況做出實時無創(chuàng)的評價。臨床使用的超聲造影劑 SonoVue平均粒徑 2.5 微米，不能透過血管壁進入組織間隙，為純血池造影劑， 直接反映腫瘤內的滋養(yǎng)血管和微血管。 利用超聲造影分析軟件，可以繪制時間 -強度曲線，得到血流灌注參數(shù)，如：達峰時間、相對峰值強度、曲線下面積等，來反應病灶血流動力學改變28 ，間接評估腫瘤的MVD 。因此利用Sonovue超聲造影并進行 TIC 定量分析是判斷腫瘤血管生成情況的良好的影像學方法29 。ROI 包繞整個腫瘤，隨時間的變化 ROI 內信號強度的變化反映了微泡濃度的變化,24華中科技大學碩士

57、學位論文微泡濃度的變化進一步反映了組織血流灌注量的變化。因此由造影強度可了解組織的血流灌注情況。治療后 24h 免疫組化 CD31 染色獲得的 MVD 計數(shù)在 NB+L-US(1.5w/ cm2)治療組明顯低于對照組， 24hCEUS 獲得的 VI 在 NB+L-US(1.5w/cm 2)治療組也明顯低于對照組，都具有顯著統(tǒng)計學差異（P0.01）。VI 值能反應腫瘤血供的變化情況，與 MVD 計數(shù)表現(xiàn)出一致性。王知力 30 等應用 AcQ 定量分析軟件及對比脈沖序列技術，行超聲造影檢查肝細胞癌患者腫瘤病灶，獲得平均峰值強度（ PI）數(shù)值，同時行免疫組化分析肝癌組織中 MVD ，發(fā)現(xiàn)肝細胞癌的

58、PI 與 MVD 之間呈顯著正相關，超聲造影的峰值強度可用于評估腫瘤內微血管生成。（6）微泡聯(lián)合低功率超聲物理治療腫瘤方案的優(yōu)化從本實驗的 CEUS 直觀觀察和對VI 的統(tǒng)計分析可獲知，兩種微泡聯(lián)合超聲治療腫瘤，在治療后一段時間血供都發(fā)生恢復，Sonovue組在 24h，NB 組在 48h，原因可能是隨著時間的推移，腫瘤細胞產生各種促血管生成因子促進微血管新生，同時免疫組化也顯示 Sonovue組 48h 腫瘤周圍區(qū)域 MVD 增多。與對照組各時間點的VI 相比較，得出NB+L-US(2.5w/cm 2 )治療對腫瘤血供的抑制時間達 48h 以上，與 NB+L-US(1.5w/cm 2)治療組

59、各時間點的 VI 相比，兩者在治療后即刻、治療后 1h、治療后 24h 差異有統(tǒng)計學意義（ P0.05）。因此可以通過增大超聲功率的方法加強療效，但也要注意安全問題，本實驗中 NB+L-US(2.5w/cm 2 )治療組中兩只裸小鼠實驗中死亡，尸檢發(fā)現(xiàn)移植瘤下方肌肉組織和胸腔肺臟有淤血。因此單純一次微泡聯(lián)合低功率超聲治療， 不足以徹底摧毀腫瘤微血管 ,有必要重復治療 ,或與抗血管生成藥物的聯(lián)合應用。 另外，本研究中曾聯(lián)合抗血管生成藥物恩度觀察對腫瘤抗血管治療的效果，超聲破壞納米泡一次后連用抗腫瘤血管藥物恩度一周，行 CEUS 可以發(fā)現(xiàn) VI 較沒有聯(lián)合恩度組顯著減低， 由于數(shù)據(jù)丟失難以展示研究

60、成果，但是超聲微泡破壞腫瘤組織現(xiàn)有血管， 聯(lián)合抗血管生成藥物對 EGFR 等因子的抑制作用，確實優(yōu)化了現(xiàn)有治療方案。細胞核相關抗原 Ki67 31,32 是增殖性細胞核的標記物， 被用以估計腫瘤細胞的增殖能力。在治療后 72h 時間點，NB+L-US(1.5w/cm 2 )治療組的 Ki67 計數(shù)明顯低于對照組，差異有顯著統(tǒng)計學意義（ P0.01）。因此納米泡聯(lián)合低頻超聲治療腫瘤可以抑制腫瘤細胞增殖。25華中科技大學碩士學位論文（7）本實驗的不足之處：樣本量小，統(tǒng)計學分析可能存在偏倚；目前計算MVD 采用 1991 年由 Weidner9等提出的方法，客觀性稍差，以后盡量尋求使用高級軟件精確定