微生物技術(shù)應(yīng)用

1、微生物技術(shù)在環(huán)境領(lǐng)域中的新應(yīng)用Application of microbial technology in environments 1主要內(nèi)容固定化微生物技術(shù)微生物制劑微生物細胞外多聚物2一、固定化酶與固定化微生物Immobilization enzyme and microbes3酶的化學(xué)本質(zhì) 酶(Enzyme)是由活細胞產(chǎn)生的，以蛋白質(zhì)為主要成分，具有高效率、高特異性的生物催化劑(catalysts)，具有許多與蛋白質(zhì)相同的物理化學(xué)性質(zhì)。1. 兩性離子的性質(zhì)：氨基酸2. 酶具有膠體性質(zhì)：大分子3. 熱穩(wěn)定性較差：次級鍵4. 可溶解性：親疏水性5. 酶的變性：次級鍵4酶催化反應(yīng)的特性1、高

2、效性 highly activity2、專一性 specficity3、條件溫和 mild conditions4、不穩(wěn)定性 unsteadiness5、可調(diào)控性 regulation6、輔因子作用 cofactor5酶催化反應(yīng)的缺陷作為活性蛋白，其穩(wěn)定性易受溫度、pH、無機離子的影響；一般在水溶液中反應(yīng)，不利于酶回收；酶與反應(yīng)物及產(chǎn)物混合，不利于產(chǎn)物進一步提純。6改進措施固定化酶固定化酶和固定化細胞是利用物理及化學(xué)的處理方法，將水溶性酶或細胞與固體的水不溶性支持物（或稱載體）相結(jié)合，使其既不溶于水，又能保持酶和微生物的活性。它們在固相狀態(tài)下增加了機械強度，穩(wěn)定性提高，可回收反復(fù)使用，并在貯存

3、較長時間后依然保持酶和微生物的活性不變。 7 1953年，Grubhofev和Schleith首先開始了 酶固定化研究，并第一次實現(xiàn)了酶的固定化。 1960年，日本的千畑一郎開始了氨基酰化酶固 定化研究，開始了將固定酶應(yīng)用在工業(yè)上的第 一步。 1969年，千畑一郎成功地將氨基?；阜磻?yīng)用 于DL-AA的光學(xué)分析，實現(xiàn)了酶連續(xù)反應(yīng)的工業(yè) 化。這是世界上固定化酶用于工業(yè)的開端。 1973年，千畑一郎再次在工業(yè)上成功地固定化 大腸桿菌細胞，成功實現(xiàn)了L-天冬氨酸連續(xù)生 產(chǎn)。8酶的固定化 通過某些物理或化學(xué)方法處理，使酶變成不易隨水流失（即運動受到限制）而又能發(fā)揮高效催化作用的酶制劑，這一過程稱為酶的

4、固定化。 固定化所采用的酶，可以是純化的酶，也可以是結(jié)合在菌體（死細胞）或細胞碎片上的酶或酶系。9酶的分離純化10酶的來源盡管可以從幾乎所有生物體提取到活性酶，但目前產(chǎn)業(yè)化的固定化酶主要來源于微生物，其中真菌約50%，細菌約1/3，動物約8%，植物約4%。一方面是因為微生物酶更廉價，更容易擴增并定量；同時也因為動植物組織可能含有潛在的有害成分。11Enzyme ECSourcesApplicationa-Amylase3.2.1.1AspergillusEBakingCatalase1.11.1.6AspergillusIFoodCellulase3.2.1.4TrichodermaEWast

5、eDextranase3.2.1.11PenicilliumEFoodGlucose oxidase1.1.3.4AspergillusIFoodLactase3.2.1.23AspergillusEDairyLipase3.1.1.3RhizopusEFoodRennet3.4.23.6Mucor mieheiECheesePectinase3.2.1.15AspergillusEDrinksProtease3.4.23.6AspergillusEBakingE: extracellular enzyme; I: intracellular enzymeFungal Enzymes12Enz

6、ymeSourcesApplicationa-Amylase3.2.1.1BacillusEStarchb-Amylase3.2.1.2BacillusEStarchAsparaginase3.5.1.1Escherichia coliIHealthGlucose isomerase5.3.1.5BacillusIFructose syrupPenicillin amidase3.5.1.11BacillusIPharmaceuticalProtease3.4.21.14BacillusEDetergentBacterial EnzymesE: extracellular enzyme; I:

7、 intracellular enzyme13酶的固定化方法吸附法：通過氫鍵、疏水作用和電子親和力等物理作用，將酶固定于水不溶多孔載體上包埋法：將聚合物的單體與酶溶液混合，再借助于聚合助進劑(包括交聯(lián)劑)的作用進行聚合，酶被包埋在聚合物；結(jié)合法：選擇適宜的載體，使之通過共價鍵或離子鍵與酶蛋白側(cè)鏈基團結(jié)合而制成固定化酶；交聯(lián)法：借助雙功能試劑使酶分子之間或酶與載體間發(fā)生交聯(lián)作用而制成固定化酶；熱處理法：將含酶細胞在一定的溫度下加熱一段時間，使酶固定在菌體內(nèi)。14固定化方法 酶和細胞固定化方法 載體結(jié)合法 交聯(lián)法 包埋法 網(wǎng)格型 微囊型物理吸附法 離子結(jié)合法 共價結(jié)合法 熱處理（細胞）15吸附法（

8、adsorption）常用有機載體 纖維素、骨膠原、火棉膠及面筋、蔗渣等常用無機載體 氧化鋁、硅藻土、沸石、高嶺土、多孔玻璃、硅膠等16影響吸附法固定酶穩(wěn)定性的因素介質(zhì)中離子強度 鹽析pH 電荷溫度 熱運動蛋白質(zhì)濃度 交換載體的性質(zhì) 表面特性17吸附法的特點吸附法的優(yōu)點：操作簡單，可供選擇的載體類型多，吸附過程可同時達到純化和固化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。吸附法的缺點：酶和載體的結(jié)合力不強，易脫落，會導(dǎo)致催化活力的喪失和沾污反應(yīng)產(chǎn)物。世界第一例獲得工業(yè)應(yīng)用的固定化酶是 DEAE-Sephadex A-25吸附的氨基酰化酶反應(yīng)用于DL-AA的光學(xué)分析。 18包埋法(e

9、ntrapment)凝膠包埋法 將酶分子包埋在凝膠格子中 聚合包埋 聚丙烯酰胺 絡(luò)合包埋 膠原、海藻酸鈉 凝結(jié)包埋 明膠、卡拉膠、淀粉、微囊法 包埋于半透性聚合物膜的微囊內(nèi) 界面沉淀 高聚物在水和有機相界面上溶解度較低 界面聚合 液體干燥法 脂質(zhì)體包埋19包埋法的特點 包埋法操作簡單，由于酶分子只被包埋，未受到化學(xué)反應(yīng)，可以制得較高活力的固定化酶對大多數(shù)酶、粗酶制劑甚至完整的微生物細胞都是適用的。 但是，只有小分子底物和產(chǎn)物可以通過凝膠網(wǎng)絡(luò)，而對大分子底物不適宜。同時，凝膠網(wǎng)絡(luò)對物質(zhì)擴散的阻力導(dǎo)致固定化酶動力學(xué)行為的變化、活力降低。20共價結(jié)合法(Covalent)理論上酶蛋白上可供載體結(jié)合的

10、功能基團有：酶蛋白N-端的M-氨基或賴氨酸殘基的-氨基；酶蛋白C-端的羧基以及Asp殘基的-羧基和Glu殘基-羧基；Cys殘基的巰基；Ser、Tyr、Thr殘基的羥基；Phe和Tyr殘基的苯環(huán)；His殘基的咪唑基；Trp殘基的吲哚基。 最普遍的基團是：氨基、羧基以及苯環(huán)，且被偶聯(lián)的基團應(yīng)是酶活性的非必需基團21共價結(jié)合的影響因素載體的物化性質(zhì)要求載體親水，并且有一定的機械強度和穩(wěn)定性，同時具備在溫和條件下與酶結(jié)合的功能基團；偶聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)條件必須在溫和pH、中等離子強度和低溫的緩沖溶液中；所選擇的偶聯(lián)反應(yīng)要盡量考慮到對酶的其它功能基團副反應(yīng)盡可能少；要考慮到酶固定化后的構(gòu)型，盡量減少載體的空間

11、位阻對酶活力的影響。22共價載體的選擇一般而言，親水載體在蛋白質(zhì)結(jié)合量和固定化酶活力及其穩(wěn)定性上都優(yōu)于疏水載體；載體結(jié)構(gòu)疏松，表面積大，有一定的機械強度；載體必須有在溫和條件與酶共價結(jié)合的功能基團；載體沒有或很少有非專一性吸附；載體來源廣泛，廉價并能反復(fù)使用。23共價偶聯(lián)法的優(yōu)缺點共價偶聯(lián)法的優(yōu)點：得到的固定化酶結(jié)合牢固、穩(wěn)定性好、利于連續(xù)使用共價偶聯(lián)法的缺點：載體活化的操作復(fù)雜，反應(yīng)條件激烈，需要嚴格控制條件才可以獲得較高活力的固定化酶。同時共價結(jié)合會影響到酶的空間構(gòu)象，從而對酶的催化活性產(chǎn)生影響。24形成共價結(jié)合的偶聯(lián)類型重氮法 是將帶芳香族氨基的載體，先用NaNO2和稀鹽酸酸處理成重氮鹽

12、衍生物，再在中性偏堿(pH8-9)條件下與酶蛋白發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，得到固定化酶。鹵代烴烷基化反應(yīng) 具有鹵素取代的芳香環(huán)或含有鹵素取代的雜環(huán)的高聚物以及含有鹵乙?；母呔畚铮梢酝ㄟ^烷基化、芳香基化，在堿性條件下，與酶分子上的氨基、酚基、巰基等反應(yīng)。25重氮法-1 多糖類的芳香族氨基衍生物 在堿性條件下用對-硫酸脂乙砜基胺多糖，制得的醚鍵連接的乙砜基苯胺衍生物，經(jīng)重氮化后偶聯(lián)酶；26重氮法-2氨基酸共聚體 共聚物與亞硝酸作用轉(zhuǎn)變?yōu)橹氐}，可供酶固定用。蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等27重氮法-3 聚丙烯酰胺衍生物 EnzacryIAA是含有芳香氨基的聚丙烯酰胺衍生物，經(jīng)重氮化可固定酶；氨基酰化酶，淀粉酶

13、等。28重氮法-4 苯乙酰樹脂 聚氨基苯乙烯(a)和一種異丁烯一間一氨基苯乙烯(b)的共聚物，通過重氮化后可固定酶；胃蛋白酶、核糖核酸酶等。29重氮法-5 帶有羧基或羥基、羧甲基等的載體，首先在酸性條件下用甲醇處理使之酯化，再用水合肼處理形成酰肼，最后在HNO3作用下轉(zhuǎn)變成疊氮衍生物。30重氮法-6 多孔玻璃的氨基硅烷衍生物 多孔玻璃在丙酮中與Y氨基丙基三氧乙烷硅回流加熱，生成烷基胺玻璃；用對硝基苯酚氯處理后，再還原，轉(zhuǎn)變?yōu)榉枷慊苌?；此芳香基衍生物?jīng)重氮化后與酶結(jié)合，產(chǎn)生固定化酶。31鹵代烴烷基化-1 將纖維素在二惡烷(Diaxanc)-溴乙酸中與嗅乙酰溴反應(yīng)，形成溴乙酰纖維素，可供胰蛋白

14、酶、糜蛋白酶和核糖核酸酶之固定化； 常用載休有鹵乙酰、鹵異丁烯衍生物，如氯乙酰纖維素、溴乙酰纖維索、碘乙酰纖維素等。32鹵代烴烷基化-2纖維素等載體在堿性條件下和均三氯三嗪等反應(yīng)，引入活潑的鹵素基后，能與酶的氨基、酚羥基、巰基反應(yīng)，產(chǎn)生固定化酶與纖維素共價結(jié)合的另一類芳香烴化功能基是3-F-4,6-二硝基苯?？刂苝H7，使它與酶分子的氨基反應(yīng)，產(chǎn)生固定化酶。 33鹵代烴烷基化-3 四元縮合反應(yīng) 利用四元化合物(羧酸、胺、醛和異氰酸)發(fā)生縮合反應(yīng)，形成N取代的酰胺；羧酸(R1)和胺化合物(R2)形成酰胺鍵，醛(R3)和異氰酸(R4)結(jié)合形成酰胺氮的側(cè)鏈。 當(dāng)選擇適當(dāng)條件，適當(dāng)?shù)妮d體及控制反應(yīng)液中

15、的添加物，可以使連接鍵或通過酶的氨基或通過羧基，將酶固定并免除有害反應(yīng)。34鹵代烴烷基化-4巰基-二硫基交換反應(yīng) 帶有-SH或二硫基的載體，通過巰基-二硫基的交換反應(yīng)，和酶分子上非必需巰基偶聯(lián)。若載體的功能基團為-SH時，可先用2,2-二吡啶二硫化物處理，生成的二硫基中間產(chǎn)物在酸性條件下能與酶分子的巰基發(fā)生交換反應(yīng)，從而產(chǎn)生固定化酶。35鹵代烴烷基化-5金屬偶聯(lián)法 利用某些過渡金屬鹽溶液將載體(纖維素、尼龍、硼硅玻璃、濾紙及酵母細胞等)浸泡24h，洗除末反應(yīng)的金屬鹽后，制得的活化載體放入酶溶液中，即可將酶固定化。36芳香烴化-6 溴化氰-亞胺碳酸基反應(yīng) 含有羥基的載體(如纖維素、葡聚糖、瓊脂等

16、)在堿性條件下，載體的羥基與CNBr反應(yīng)，生成活潑的亞胺碳酸基，在弱堿條件下，可與酶分子的氨基偶聯(lián)固定。37芳香烴化-7 酰氯化反應(yīng) 含羧基載體如羧基樹脂(Amberlite IRC-50等)，可用氯化亞砜處理，生成酰氯衍生物，與酶分子的氨基偶聯(lián)，產(chǎn)生固定化酶。38縮合法 縮合反應(yīng) 一些帶羧基或氨基的載體用羰二亞胺活化后，與酶分子的氨基或羧基直接偶聯(lián)，形成肽鍵，產(chǎn)生固定化酶。39芳香氨異硫氰反應(yīng)含有芳香氨基的載體，在堿性PH條件下，與光氣或硫芥子氣反應(yīng)生成異硫氰酸或異琉氰酸衍生物，可在溫和條件下與酶分子的氨基連接，產(chǎn)生固定化酶。40酸酐反應(yīng)乙烯或苯乙烯、甲代乙烯基與順丁烯二酸酐的共聚物，在己二

17、胺作用下，酸酐與酶蛋白的氨基起偶聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生固定化酶。41活化酯法含羧基的共聚物載體在二環(huán)己基碳二亞胺(DDC)存在下用N羥基琥珀酰亞胺活化，產(chǎn)生活化酯，再在溫和條件下連接酶。42含醛基高聚物多糖類如淀粉、葡聚糖、纖維素等用高碘酸或二甲基砜氧化裂解葡萄糖環(huán)，形成含醛基(每一葡萄糖產(chǎn)生兩個醛基)高聚物，可與酶蛋白氨基反應(yīng)，產(chǎn)生固定化酶。43交聯(lián)法基本原理是酶分子和多功能試劑之間形成共價鍵得到三維的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；交聯(lián)法是利用雙功能或多功能試劑在酶分子間、酶分子與惰性蛋白間或酶分子與載體間進行交聯(lián)反應(yīng)，把酶蛋白分子彼此交叉連接起來，形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的固定化酶。常用的交聯(lián)試劑是戊二醛和雙耦聯(lián)苯胺-2,2-

18、二磺酸，常與吸附法或包埋法配合使用44交聯(lián)法的類型交聯(lián)酶法 在一定條件下，加入一定量的戊二醛溶液于酶溶液中，生成不溶性固定化酶；酶與輔助蛋白交聯(lián)法 用雙功能或多功能試劑使惰性蛋白與酶共交聯(lián)；吸附交聯(lián)法 將酶吸附載體上，再用戊二醛等雙功能試劑交聯(lián)；載體交聯(lián)法 用多或雙功能試劑的一部分功能基團與載體交聯(lián)，另一部分功能基團與酶蛋白交聯(lián)而制備固定化酶的方法；45交聯(lián)法的優(yōu)缺點用交聯(lián)法制備的固定化酶結(jié)合牢固，可長時使用。但由于交聯(lián)反應(yīng)較激烈，酶分子的多個基團被交聯(lián)，酶活力損失較大；且交聯(lián)劑的成本較高，實際使用時，往往與其他固定化方法聯(lián)用，如將酶先經(jīng)凝膠包埋后，再經(jīng)交聯(lián)等。 46固定化酶制備方法的特點物理

19、吸附包埋法共價結(jié)合法共價交聯(lián)法制備易易難難結(jié)合力弱強強強酶活力高高中中底物專一性無變化無變化有變化有變化再生可能不可能不可能不可能固定化費用低中高中47固定化方法與載體的選擇1.必須注意維持酶的催化活性和專一性2.酶與載體結(jié)合牢固 3.載體的機械強度4.固定化酶要有最小的空間位阻 5.載體穩(wěn)定，不可與底物、產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)6.固定化酶要廉價48固定化酶的特點 具有生物催化劑的功能，又有固相催化劑的功能?？芍貜?fù)使用酶底物產(chǎn)物易分開反應(yīng)條件易控制酶的利用效率高比水溶性酶更適合于多酶反應(yīng)49固定化酶的酶活力多數(shù)固定化酶活性均有所下降，原因主要有：酶分子在固定化過程中，酶的空間構(gòu)像發(fā)生了變化，甚至活性中心

20、的氨基酸也會參加反應(yīng)；固定化后的空間障礙效應(yīng)的影響；內(nèi)擴散阻力的影響使底物分子與活性中心的接近受阻；包埋法時被高分子物質(zhì)半透膜包圍。50酶固定化效果的測定 固定化酶活力測定基本上與溶液酶相似，即每毫克干重固定化酶每分鐘轉(zhuǎn)化1umol底物量或形成1umol產(chǎn)物的酶量為一個單位(umol/mgmin)，對于酶管、酶膜、酶板等，則以單位面積（cm2）的初速度來表示。51由于在固定化中酶往往會有些失活，因此，測定殘留活力還不能正確反映與載體結(jié)合的酶活力，所以，仍以測定蛋白量較為難確。在酶固定化操作中，當(dāng)酶與載體結(jié)合后，用適量適當(dāng)?shù)木彌_液淋洗固定化酶，以洗除未固定的酶，收集洗脫液，并測定其中蛋白量(或酶

21、活力)，即為殘留的蛋白量(或酶活力)。固定化效率52固定化酶的穩(wěn)定性多數(shù)酶的穩(wěn)定性在固定化后都有所提高，延長了有效壽命，這是由于：第一，固定化增加了酶構(gòu)象的牢固程度；第二、擋住了不利因素對酶的侵襲；第三，限制了酶分子間的相互作用；但是，如果固定化觸及到酶活性敏感區(qū)域，也可能導(dǎo)致酶穩(wěn)定性下降。53固定化酶（細胞）熱穩(wěn)定性變化54固定化酶（細胞）對有機試劑（乙醇）穩(wěn)定性變化55固定化酶（細胞）對酶抑制劑（尿素）的穩(wěn)定性變化56固定化酶（細胞）對pH穩(wěn)定性變化57pH-酶活力關(guān)系反應(yīng)的最適pH和酶活力pH曲線的變動依據(jù)酶蛋白和載體的電荷而定。帶負電荷的載體，往往導(dǎo)致固定化酶的最適pH向堿性方向移動；

22、帶正電荷的載體則相反。盡管大多數(shù)固定化酶的活力pH關(guān)系曲線仍為鐘形曲線，但與溶液酶比較，其鐘形更陡，或更坦，向酸性或堿性方向偏移。58對蛋白酶的抵抗力提高氨基?；冈谝鹊鞍酌缸饔孟禄盍H存20，而將其固定于DEAE纖維素上在同樣條件下仍有80的活力。這可能是因為蛋白酶分子量大，受到空間位阻，不能進入固定化酶中；對變性劑、抑制劑的抵抗能力提高氨基?；概c固定于DEAESephadex的氨基?；副容^，前者在6mol、2mol胍、1SDS和4mmol丙酮溶液中活力分別為9、49、1和55，而后者在相應(yīng)溶液中活力則分別為146、117、35和138。59 固定化酶在操作中可以長期使用，半衰期(t1/

23、2)，即酶活性達到原有酶活性一半時所需的時間)較長。半衰期可按下式計算：式中ED為反應(yīng)t時的酶濃度，E為原有酶濃度。操作穩(wěn)定性60部分固定化酶的半衰期61固定化酶的反應(yīng)器類型62Batch Stirred tank reactor,BSTR 結(jié)構(gòu)簡單，不需要特殊設(shè)備，適于小規(guī)模實驗。一般應(yīng)用溶液酶或粗酶制劑催化，酶不回收，待反應(yīng)轉(zhuǎn)化至一定程度后，通過加熱或其他方法直接使之失效除去。但在反復(fù)過濾或離心回收過程中，易造成酶的失效損失。工業(yè)上很少用.63Continuous Stirred tank reactor,CSTR 催化劑采用顆粒狀的固定化酶，少數(shù)應(yīng)用片狀固定化酶。運轉(zhuǎn)過程中要不斷分出部分

24、反應(yīng)液，同時補充等量的新鮮底物溶液，為不致使酶隨反應(yīng)液流失，所以在它的出口處通常有濾膜。用于有底物抑制場合。64Plug Flow reactor,PFR 填充床內(nèi)用顆粒狀或片狀固定化酶填充，運轉(zhuǎn)時，底物按一定方向以恒定速度通過反應(yīng)床，沿流動方向底物及產(chǎn)物的濃度逐漸變化，但同一橫切面上濃度一致。使用最普遍。 固定化酶堆積密度大，但床內(nèi)壓降大，固定化酶清洗更換麻煩。65Fluidized bed reactor,FBR 底物溶液以足夠大的流速向上通過固定化酶床層，使固體顆粒處于流化狀態(tài)?；旌铣潭雀?，故傳熱、傳質(zhì)情況良好?？捎糜谔幚碚承詮姾秃泄腆w顆粒的底物，或用于需要供應(yīng)氣體或排放氣體的反應(yīng)。

25、傳質(zhì)效果好，不容易堵塞；但需要保持較高的流速，動力消耗大，且固定化酶濃度低，顆粒處于流態(tài)化，易損耗。66CSTR/Ultrfitration reactor,CSTR/UFR 由連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器和超濾裝置組合而成，為小分子量產(chǎn)物與高分子底物的分離、底物較徹底的轉(zhuǎn)化以及溶液酶或固定化酶的反復(fù)使用提供了可能。但酶易因循環(huán)超濾而失效損失。67Recycle reactor,RCR 把部分流出物與加料流混合，然后再令其進入反應(yīng)器。特點是可以提高液體的流速和減少底物向固定化酶表面?zhèn)鬟f的阻力。68固定化酶反應(yīng)器的選擇根據(jù)固定化酶的形狀來選擇根據(jù)底物的物理性質(zhì)來選擇根據(jù)反應(yīng)的動力學(xué)特性來選擇根據(jù)外界環(huán)境

26、對酶穩(wěn)定性的影響選擇根據(jù)操作要求及反應(yīng)器費用來選擇69固定化酶的形狀一般言之，顆粒狀或片狀固定化酶對連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器和填充式反應(yīng)器類型的反應(yīng)器均可適用。但膜狀和纖維狀的固定化酶則不適于連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器，而適用于填充式反應(yīng)器。若固定化酶易變形、易粘結(jié)或顆粒細小時，那么在填充于填充式反應(yīng)器后，往往會引起高的壓力降和堵塞床層，并且在大規(guī)模生產(chǎn)中無法實現(xiàn)高的流率。此時宜采用流動床反應(yīng)器。70底物的物理性質(zhì)底物分三種情況：溶解性物質(zhì)、顆粒物質(zhì)與膠狀物質(zhì)。溶解性底物顯然對任何類型反應(yīng)器均不會造成困難。顆粒狀和膠狀底物則往往會導(dǎo)致床層堵塞，對此可用循環(huán)反應(yīng)器或流動床反應(yīng)器。連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器只要攪

27、拌速度足夠高，能維持底物和固定化酶良好的懸浮狀態(tài)，也可用于顆粒狀底物。但高的攪拌速度會導(dǎo)致固定化酶從載體上被剪切下來，所以轉(zhuǎn)速不能太高。71酶反應(yīng)動力學(xué)特性 一般而言，填充床反應(yīng)器在固定化酶反應(yīng)器中占有主導(dǎo)地位，它適合于產(chǎn)物抑制的場合；但在底物抑制的系統(tǒng)中，則連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器的性能又優(yōu)于填充床。流動床反應(yīng)器因其流動特性接近連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器，故也適宜于底物抑制的反應(yīng)。72酶的穩(wěn)定性在反應(yīng)器操作過程中，由于攪拌漿或液流的剪切作用，常會使固定的酶從載體上脫落下來，或由于磨損，引起粒度的減小而影響固定化酶的操作穩(wěn)定性，其中尤以連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器最為嚴重。為解決這一問題而改進反應(yīng)器設(shè)計，是把酶

28、直接粘接在攪拌軸上，或把固定酶設(shè)置在與軸相連的金屬網(wǎng)籃內(nèi)。73操作要求及反應(yīng)器費用 連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器是最便宜的，它結(jié)構(gòu)簡單，且具有良好的操作性，適應(yīng)性強；而其他類型的反應(yīng)器，則都需為特定的生產(chǎn)過程專門設(shè)計和制造。在討論反應(yīng)器價格的同時，還應(yīng)該考慮固定化酶本身的費用，及在各種反應(yīng)器中的穩(wěn)定性。74固定化對酶反應(yīng)系統(tǒng)的影響 固定化對酶活性和酶反應(yīng)體系的影響是十分復(fù)雜的，常因酶的種類、反應(yīng)系統(tǒng)的組成，特別是固定的方法及載體而顯著不同。為了簡化，通常作兩個假設(shè)：酶在載體表面或多孔介質(zhì)內(nèi)的分布是完全均勻的。整個系統(tǒng)各方同性。75構(gòu)象改變和屏蔽效應(yīng)酶在固定化的過程中，出于酶與載休相互作用使酶的活性中心

29、或變構(gòu)中心的構(gòu)象發(fā)生變化從而導(dǎo)致酶活性下降。這種效應(yīng)難以定量描寫，也難以預(yù)測。通常出現(xiàn)在吸附法和共價鍵結(jié)合法。立體屏蔽效應(yīng)是由于載體對酶的活性中心或變構(gòu)中心造成空間障礙，因而底物或效應(yīng)物與酶無法接觸，從而影響酶的活性。若在酶和載體間加入臂，可以得到改善76微環(huán)境的影響微環(huán)境是緊鄰固定化酶的環(huán)境區(qū)域。微環(huán)境的影響是由于載體的親水與疏水性質(zhì)和介質(zhì)的介電常數(shù)等直接影響酶的催化效本，或者是酶對效應(yīng)物作出反應(yīng)的能力的一種效應(yīng)，通常可以通過改變載體和介質(zhì)的性質(zhì)作出判斷和調(diào)節(jié)。77分配效應(yīng)由于載體的親水和疏水性質(zhì)使底物、產(chǎn)物或其他效應(yīng)物在微觀環(huán)境和宏觀體系間發(fā)生不等分配，改變了酶反應(yīng)系統(tǒng)的組成平衡，從而影響

30、了反應(yīng)速度。78分配效應(yīng)的影響載體與底物帶有相同電荷，則酶的Km值將因固定化而增大；如果帶有相反電荷則相反。當(dāng)載體帶正電荷時，固定化之后，酶活性一PH曲線向酸性方向偏移；相反，陰離子載體將導(dǎo)致該曲線向堿性方向偏移。以上效應(yīng)可通過提高介質(zhì)離子強度而削弱或消除。采用疏水載體時，如底物為極性物質(zhì)，或電荷物質(zhì)，則酶的Km值將因固定化而降低，其他效應(yīng)物亦然。79擴散效應(yīng)擴散限制效應(yīng)是指：底物或其他效應(yīng)物的遷移和運轉(zhuǎn)受到限制的一 種效應(yīng)。它分內(nèi)擴散效應(yīng)和外擴散效應(yīng)兩種。外擴散限制，是指上述物質(zhì)從宏觀體系穿過包圍在固定化酶周圍近乎停滯的液膜(Nernst)層到固定化酶表面所受到的限制，可以充分攪拌或混合而減

31、小或消除。內(nèi)擴散限制，是指上述物質(zhì)從固定化酶表面來到顆粒內(nèi)部酶活性位點受到的一種限制。80固定化酶的優(yōu)點極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開，簡化了提純工藝；穩(wěn)定性提高，可長時間反復(fù)使用，有利于工藝的連續(xù)化、工業(yè)化；酶反應(yīng)過程可以嚴格控制，有利于工藝自動化和微電腦化；較能適應(yīng)于多酶反應(yīng)；酶的使用效率提高，產(chǎn)物得率提高，產(chǎn)品質(zhì)量有保障，成本低。81固定化酶的缺點由于底物須經(jīng)擴散才能和載體上的酶接觸，反應(yīng)產(chǎn)物也要經(jīng)擴散進入液相，固定化酶速度一般低于可溶性酶；不適用于不溶性底物及大分子底物，也不適于多酶反應(yīng)，特別是需要輔因子的反應(yīng)；應(yīng)用過程中酶可能從載體上流失，且由于化學(xué)反應(yīng)、空氣或固態(tài)污染物堵塞酶的活力

32、中心和載體的結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致酶活力下降。82固定化酶與固定化細胞的應(yīng)用工業(yè)發(fā)酵生物傳感器生物化學(xué)及分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究藥物控釋載體廢水/氣生物處理83固定化酶應(yīng)用實例固定化酶應(yīng)用生產(chǎn)時間氨基?；D(zhuǎn)移酶DL-氨基酸的旋光度解析1969葡萄糖異構(gòu)酶將葡萄糖異構(gòu)變?yōu)楣?973青霉素酰胺酶生產(chǎn)6-APA1973天冬氨酸酶生產(chǎn)L-天冬氨酸1973延胡索酸酶生產(chǎn)L-蘋果酸1974-半乳糖苷酶水解乳糖1977L-天冬氨酸-脫羧酶生產(chǎn)L-丙氨酸198284固定化葡萄糖異構(gòu)酶實例 作為蔗糖的替代品，果糖不會像蔗糖那樣誘發(fā)肥胖、糖尿病、齲齒和心血管病，對人的健康有利。 反應(yīng)柱能連續(xù)使用半年，大大降低了生產(chǎn)成本，提高果糖

33、的產(chǎn)量和質(zhì)量。85固定化細胞法生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸技術(shù)路線 E.Coli 斜面 細胞 固定化細胞 青霉素G 轉(zhuǎn)化液 濾液 6-APA 粗品培養(yǎng)固定轉(zhuǎn)化過濾抽提86二、微生物制劑Microbial preparation87定義 微生物制劑是依據(jù)微生物之間生態(tài)位的共生性原理通過篩選、馴化、誘變等技術(shù)手段組合形成的具有特定功能的微生物菌群。又稱為微生態(tài)調(diào)節(jié)劑(Microecological modulator)、EM(Efficient microbe agent)菌制劑。 要求微生物種類多，共生性關(guān)系緊密，環(huán)境適應(yīng)性強，種群結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定。定 義88微生物制劑的配置原則1微生物生理學(xué)原理 微生物生

34、理學(xué)的本質(zhì)就是研究微生物生命活動及其作用有機質(zhì)的化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系，以及微生物生命活動過程中的化學(xué)變化規(guī)律。 微生物的新陳代謝是在酶催化作用下的物質(zhì)與能量攝入與利用，由于各種微生物酶系的局限性，一般需要多種微生物協(xié)同作用才能完成整個物質(zhì)能量循環(huán)過程。89微生物制劑的配置原則2微生物生態(tài)學(xué)原理 微生物生態(tài)就是研究微生物與其存賦環(huán)境中物理化學(xué)、生物等因子間的相互關(guān)系。 微生物的新陳代謝作用是受外界環(huán)境因子控制的。由于微生物生命活動過程不僅要與其存賦環(huán)境發(fā)生能量、物質(zhì)交換，且其酶催化反應(yīng)受各種環(huán)境因子的影響。微生物間的生態(tài)關(guān)系：競爭、互生、拮抗、共生90微生物制劑的配制方式篩選出優(yōu)勢菌株

35、后根據(jù)其生理生態(tài)學(xué)需求進行復(fù)配(微生物法)；篩選出優(yōu)勢微生物菌群后，依據(jù)生理生態(tài)學(xué)原理進行檢驗，并刪補相關(guān)微生物(生態(tài)法)。91微生物法及其特點可迅速提高微生物濃度，并有可能短期內(nèi)提高微生物的生物降解速率；微生物可能出現(xiàn)現(xiàn)場適應(yīng)性較差，代謝活性降低的現(xiàn)象，需要多次投放；純種微生物菌株的可培養(yǎng)性較差，難以篩選到特定目標(biāo)微生物；不太適用于地下污水層的處理；受政策限制。92微生態(tài)法及其特點采用理化、生物手段強化現(xiàn)場微生物菌群，適應(yīng)性好，但相對速率較慢；難以確知治理所需的時間以及估計最終可能達到的污染物濃度；費用少于微生物法；不適于處理分散的污染物和濃度過高或過低的污染物。93生物制劑的特點針對性強，

36、處理效率高產(chǎn)品多樣性好，用途廣泛馴化時間短，工作效率高生態(tài)安全性高，操作簡便量小分散連續(xù)性94微生物制劑存在的問題微生物對環(huán)境條件的溫度、pH、離子強度、氧化還原電位、營養(yǎng)等非常敏感，導(dǎo)致各菌種生長速率不等，因而很難保持種群結(jié)構(gòu)的相對穩(wěn)定性。研究中多因素間的相互作用難以詮釋，而單因素的作用缺乏有效的指導(dǎo)意義。在當(dāng)前復(fù)合菌劑的開發(fā)中，關(guān)鍵是對微生物的復(fù)合機理沒有成熟方法和規(guī)律可循。95典型微生物制劑-EMEM是有效微生物群(Effective Microoganism)的英文縮寫，由日本琉球大學(xué)比嘉照夫教授于20世紀80年代初發(fā)明、其代表產(chǎn)品為BM-1號(又稱EM原液)，是建立和發(fā)展無公害綠色農(nóng)

37、業(yè)的重要生物技術(shù)。EM原液通過采用適當(dāng)?shù)谋壤酮毺氐陌l(fā)酵工藝將好氧性和嫌氧性有益微生物混合培養(yǎng)，形成多種多樣的微生物群落，它們在生長中產(chǎn)生的有益物質(zhì)及其分泌物質(zhì)成為各自或相互生長的底物，通過這樣一種互生增殖關(guān)系，組成了復(fù)雜而穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)。96作用機理EM茵群作用的基本原理是基于頭領(lǐng)效應(yīng)的微生物群體生存理論和抗氧化學(xué)說，以光合菌為中心，與固氮菌并存、繁殖，采用適當(dāng)比例和獨特的發(fā)酵工藝，把經(jīng)過仔細篩選好氧和厭氧微生物加以混合后，培養(yǎng)出多功能的微生物群落。97微生物構(gòu)成它由5大類微生物中的80多個種類構(gòu)成光合菌乳酸菌酵母菌放線菌發(fā)酵型絲狀菌98EM應(yīng)用于污水處理的優(yōu)點 EM菌群依靠相互間共生增殖

38、及協(xié)同作用，代謝出抗氧化物質(zhì)，并抑制有害微生物的生長繁殖，激活水中原有微生物，通過這些生物的綜合效應(yīng)達到凈化水體的目的。處理效能提升污泥產(chǎn)量少曝氣強度低抗沖擊性強臭氣性物質(zhì)減少99EM應(yīng)用于富營養(yǎng)化污染控制100EM菌抑藻機理菌藻互作 EM的高效抑藻作用可能是通過相互間的競爭性生長、持續(xù)的藻菌互作過程產(chǎn)生的；而相互間不同的生長、繁殖方式，不同的生物代謝過程(包括吸收、降解、轉(zhuǎn)化、分泌等)極可能是EM與藻類互作過程及抑制作用的內(nèi)在機制。 我們的研究表明，其很有可能是微生物對營養(yǎng)元素的利用及其生長代謝產(chǎn)物對藻的抑制作用達成的。101102三、微生物表面活性劑Microbial surfactant

39、s103定 義生物表面活性劑(biosurfactant，簡稱Bs)是指利用酶或微生物通過生物催化和生物合成方法得到的具有表面活性的生物大分子物質(zhì)，如糖脂類、氨基酸類、蛋白質(zhì)類等表面活性劑。一般為陰離子型或非離子型，較少陽離子型。104與傳統(tǒng)化學(xué)表面活性劑的對比105微生物表面活性劑的優(yōu)點 更強的表面和界面活性; 對熱的穩(wěn)定性; 對離子強度的穩(wěn)定性; 生物可降解性; 破乳性。制備原料來源廣泛，生產(chǎn)工藝簡單，設(shè)備要求低。106生物表面活性劑分類糖脂：鼠李糖脂、海藻糖脂、槐糖脂脂肽和脂蛋白：氨基酸脂脂肪酸和磷脂：磷脂酰乙醇胺聚合物：陰離子雜多糖全胞表面：不動桿菌產(chǎn)生的囊泡 107糖脂鼠李糖脂(假單

40、胞菌)海藻糖脂(分枝桿菌、棒桿菌)108O-CH- CH2 - CH2 - CH2 - CH2 - CH2 - CH2 - CH3C-CH2-CH - CH2 - CH2 - CH2 - CH2 - CH2 - CH2 - CH3O-OOHOOH ORCH3ORhamnolipid monomerMicelle formation at CMC concentrationsCMC = 0.1 mM (50mg/L)O=CCH2Ca2+5 nm diameter產(chǎn)生鼠李糖脂的主要微生物：假單胞菌109脂肽與脂蛋白產(chǎn)生脂肽的主要微生物：芽孢桿菌pH8.5的0.1M NaOH中，CMC為9.4 10-6M酸性條件下帶負電荷，具有離子載體和螯合的性質(zhì)110pH對脂肽溶液表面張力的影響111NaCl對脂肽溶液表面張力的影響112脂肪酸和磷脂甘油的C（1）和C（2）羥基被脂肪酸酯化，C（3）羥基被磷酸酯化，磷酸又與一極性醇X-OH連接，這就構(gòu)成甘油磷脂。 113陰離子雜多糖糖的支鏈上連有糖醛酸114生物表面活性劑及其產(chǎn)生微生物115發(fā)酵法生產(chǎn)表面活性劑的方法直接細胞培養(yǎng)發(fā)酵法控制細胞代謝發(fā)酵法休止細胞法加入前體誘導(dǎo)法生物表面活性劑是微生物適應(yīng)生存環(huán)境而產(chǎn)生的，其主要作用在于：促進底物分散吸收；調(diào)