畢業(yè)論文-基于ITS2序列的中藥材南蛇藤及雷公藤溯源研究

1、PAGE PAGE 1PAGE PAGE 16 本科生畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）基于ITS2序列的中藥材南蛇藤及雷公藤溯源研究 Study the Celastri Orbiculatus Radix and Tripterygii Wilfordii RadixTraceability Based on Internal Transcribed Spacer 2 Barcode基于ITS2序列的中藥材南蛇藤及雷公藤溯源研究基于ITS2序列的中藥材南蛇藤及雷公藤溯源研究 摘要目的：應(yīng)用DNA條形碼ITS2對(duì)中藥藥材南蛇藤及雷公藤進(jìn)行溯源研究，。方法：構(gòu)建南蛇藤屬及雷公藤DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，依據(jù)DNA條形

2、碼標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP），鑒定市場(chǎng)供應(yīng)的藥材南蛇藤與雷公藤。結(jié)果：15份南蛇藤中有9份正品，5份偽品，另外1份未獲得序列；7份雷公藤藥材中有2份正品，5份偽品。結(jié)論：該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)藥材市場(chǎng)供應(yīng)的南蛇藤、雷公藤藥材的快速、準(zhǔn)確鑒定，同時(shí)證實(shí)了ITS2序列作為藥材可追溯技術(shù)的可靠性。 關(guān)鍵詞ITS2序列；DNA條形碼；南蛇藤；溯源；Study the Celastri Orbiculatus Radix and Tripterygii Wilfordii Radix Traceability Based on Internal Transcribed Spacer 2 Barcode Scienc

3、e of Chinese Materia Medica MajorSU Jin Abstract: In this study,we detected the species composition of Celastri Orbiculatus Radix and Tripterygiiwilfordii Radix using ITS2 sequence as the traceability technology.A genus Celastrus DNA barcode database was successfully constructed using 50 voucher sam

4、ples from 12 Celastrus species. Based on the DNA barcoding standard operating procedure(SOP) , we used this database to identify Celastri Orbiculatus Radix and Tripterygiiwilfordii Radix decoction piece samples that were purchased from market randomly.The results showed that only 9 decoction piece s

5、amples were authentic Celastrus orbiculatus Thunb.,and only 2 decoction piece samples were authentic TripterygiumwilfordiiHook. F.,whereas the others were all Adulterants.Conclusion: this method is realized to the rapid and accurate identification of Celastri Orbiculatus Radix and Tripterygiiwilford

6、ii Radix that were purchased from market randomly, also confirmed the reliability of the ITS2 sequence as traceability technology. Key words: ITS2；DNA barcoding；Celastri Orbiculatus Radix；Traceability目錄 TOC o 1-3 h z u HYPERLINK l _Toc448097084 1 文獻(xiàn)綜述 PAGEREF _Toc448097084 h 6 HYPERLINK l _Toc448097

7、085 1.1南蛇藤及其混淆品概述 PAGEREF _Toc448097085 h 6 HYPERLINK l _Toc448097086 1.2南蛇藤及其混淆品性狀特征 PAGEREF _Toc448097086 h 7 HYPERLINK l _Toc448097087 1.3南蛇藤及其混淆品化學(xué)成分 PAGEREF _Toc448097087 h 7 HYPERLINK l _Toc448097088 1.4南蛇藤及其混淆品藥理作用研究 PAGEREF _Toc448097088 h 8 HYPERLINK l _Toc448097089 1.5 DNA條形碼技術(shù) PAGEREF _To

8、c448097089 h 8 HYPERLINK l _Toc448097090 1.6 ITS2序列 PAGEREF _Toc448097090 h 8 HYPERLINK l _Toc448097091 2 引言 PAGEREF _Toc448097091 h 9 HYPERLINK l _Toc448097092 3 實(shí)驗(yàn)材料 PAGEREF _Toc448097092 h 9 HYPERLINK l _Toc448097093 4 方法 PAGEREF _Toc448097093 h 11 HYPERLINK l _Toc448097094 4.1 DNA提取 PAGEREF _Toc

9、448097094 h 11 HYPERLINK l _Toc448097095 4.2 PCR擴(kuò)增及檢測(cè) PAGEREF _Toc448097095 h 11 HYPERLINK l _Toc448097096 4.3 數(shù)據(jù)處理 PAGEREF _Toc448097096 h 11 HYPERLINK l _Toc448097097 5 結(jié)果與分析 PAGEREF _Toc448097097 h 11 HYPERLINK l _Toc448097098 5.1 擴(kuò)增及測(cè)序成功率 PAGEREF _Toc448097098 h 11 HYPERLINK l _Toc448097099 5.2

10、變異位點(diǎn)分析 PAGEREF _Toc448097099 h 11 HYPERLINK l _Toc448097100 5.2.1 南蛇藤屬各藥用植物及雷公藤變異位點(diǎn)分析 PAGEREF _Toc448097100 h 11 HYPERLINK l _Toc448097101 5.2.2 南蛇藤屬種間及種內(nèi)遺傳距離分析 PAGEREF _Toc448097101 h 12 HYPERLINK l _Toc448097102 5.2.3 南蛇藤與雷公藤遺傳距離分析 PAGEREF _Toc448097102 h 13 HYPERLINK l _Toc448097103 5.3 鑒定市場(chǎng)供應(yīng)的商品

11、藥材南蛇藤與雷公藤 PAGEREF _Toc448097103 h 13 HYPERLINK l _Toc448097104 5.4 系統(tǒng)發(fā)育鄰接樹(shù)分析 PAGEREF _Toc448097104 h 14 HYPERLINK l _Toc448097105 6 討論 PAGEREF _Toc448097105 h 15 HYPERLINK l _Toc448097106 7 結(jié)論 PAGEREF _Toc448097106 h 16 HYPERLINK l _Toc448097107 參考文獻(xiàn) PAGEREF _Toc448097107 h 16 HYPERLINK l _Toc448097

12、108 致謝 PAGEREF _Toc448097108 h 181 文獻(xiàn)綜述1.1南蛇藤及其混淆品概述南蛇藤（Celastrus orbiculatus Thunb.）為民間習(xí)用藥材。又稱：金銀柳(盛京通志)，金紅樹(shù)、果山藤(狄爾士中國(guó)植物名錄)，藥狗旦子(邁爾氏中國(guó)植物名錄)，蔓性落霜紅(中國(guó)樹(shù)木分類(lèi)學(xué))，過(guò)山風(fēng)、掛廊鞭。香龍草(中國(guó)藥植志)，窮攪藤、老石棵子(東北藥植志)，地南蛇、過(guò)山龍( HYPERLINK /doc/3077221-3243305.html t _blank 江西中藥)，大倫藤、大南蛇、白龍、老龍皮、臭花椒( HYPERLINK /doc/4027470-422503

13、6.html t _blank 湖南藥物志)，穿山龍(泉州本草)， HYPERLINK /doc/7368171-7635332.html t _blank 老牛筋(東北常用中草藥手冊(cè))。南蛇藤是我國(guó)分布最廣的種之一，黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、山東、山西、河南、陜西、甘肅、江蘇、安徽、浙江、江西、湖北、四川等地均可見(jiàn)其蹤跡；國(guó)外分布達(dá)俄羅斯、朝鮮、日本。南蛇藤根藤、果、葉均可入藥。全年可采根、藤；夏季采摘葉；秋季采集果。曬干或鮮用均可。據(jù)常用中草藥配方記載，其性味“微辛，溫，無(wú)毒”可祛風(fēng)濕，活血脈。主治筋骨疼痛，四肢麻木，小兒驚風(fēng)，痧癥，痢疾等癥?，F(xiàn)市面上常將南蛇藤與其同科的有毒植物雷

14、公藤混淆使用，威脅臨床用藥安全。1.2南蛇藤及其混淆品性狀特征南蛇藤其原植物為落葉攀援灌木，高達(dá)3-8m小枝光滑無(wú)毛，灰棕色或棕褐色，具稀而不明顯的皮孔；腋芽小，卵狀到卵圓狀，長(zhǎng)1-3毫米。葉通常闊倒卵形，近圓形或長(zhǎng)方橢圓形，長(zhǎng)5-13厘米，寬3-9厘米，先端圓闊，具有小尖頭或短漸尖，基部闊楔形到近鈍圓形，邊緣具鋸齒，兩面光滑無(wú)毛或葉背脈上具稀疏短柔毛，側(cè)脈3-5對(duì);葉柄細(xì)長(zhǎng)1-2厘米。聚傘花序腋生，間有頂生，花序長(zhǎng)1-3厘米，小花1-3朵，偶僅1-2朵，小花梗關(guān)節(jié)在中部以下或近基部;雄花萼片鈍三角形;花瓣倒卵橢圓形或長(zhǎng)方形，長(zhǎng)3-4厘米，寬2-2.5毫米;花盤(pán)淺杯狀，裂片淺，頂端圓鈍;雄蕊長(zhǎng)

15、2-3毫米，退化雌蕊不發(fā)達(dá);雌花花冠較雄花窄小，花盤(pán)稍深厚，肉質(zhì)，退化雄蕊極短小;子房近球狀，花柱長(zhǎng)約1.5毫米，柱頭3深裂，裂端再2淺裂。蒴果近球狀，直徑8-10毫米;種子橢圓狀稍扁，長(zhǎng)4-5毫米，直徑2.5-3毫米，赤褐色?；ㄆ?-6月，果期7-10月1。雷公藤原植物為藤本 HYPERLINK /view/84139.htm t _blank 灌木，高1-3米，小枝棕紅色，具有4-6根細(xì)棱，被密毛及細(xì)密皮孔。葉橢圓形、倒卵橢圓形、長(zhǎng)方橢圓形或卵形，長(zhǎng)4-7.5厘米，寬3-4厘米，先端急尖或短漸尖，基部闊楔形或圓形，邊緣有細(xì)鋸齒，側(cè)脈4-7對(duì)，達(dá)葉緣后稍上彎；葉柄長(zhǎng)5-8毫米，密被銹色毛。

16、HYPERLINK /view/135981.htm t _blank 圓錐聚傘 HYPERLINK /view/16103.htm t _blank 花序較窄小，長(zhǎng)5-7厘米，寬3-4厘米，通常有3-5分枝，花序、分枝及小花梗均被銹色毛，花序梗長(zhǎng)1-2厘米，小花梗細(xì)長(zhǎng)達(dá)4毫米；花白色，直徑4-5毫米；萼片先端急尖；花瓣長(zhǎng)方卵形，邊緣微蝕；花盤(pán)略5裂；雄蕊插生花盤(pán)外緣，花絲長(zhǎng)達(dá)3毫米；子房具3棱，花柱柱狀，柱頭稍膨大，3裂。 HYPERLINK /view/321350.htm t _blank 翅果長(zhǎng)圓狀，長(zhǎng)1-1.5厘米，直徑1-1.2厘米，中央果體較大，約占全長(zhǎng)2/3-1/2，中央脈及2

17、側(cè)脈共5條，分離較疏，占翅寬2/3，小果梗細(xì)圓，長(zhǎng)達(dá)5毫米；種子細(xì)柱狀，長(zhǎng)達(dá)10毫米1。1.3南蛇藤及其混淆品化學(xué)成分南蛇藤的化學(xué)成分比較復(fù)雜，現(xiàn)已從其根皮、種子、葉、地上部分中分離得到了-二氫沉香呋喃型倍半萜類(lèi)及其衍生物，及一些二萜三萜類(lèi)化合物以及生物堿。此外還有甾體類(lèi)、鞣質(zhì)、有機(jī)酸、黃酮類(lèi)等。其中萜類(lèi)、生物堿、黃酮類(lèi)含量較高2。雷公藤根含雷公藤堿（wilfordine），雷公藤次堿（wilforine），雷公藤堿乙（wilforgine），雷公藤堿丁即雷公藤春堿（wil-皮 HYPERLINK /view/321266.htm t _blank 酰胺（celacinnine）， HYPER

18、LINK /view/41213.htm t _blank 南蛇藤- HYPERLINK /view/2317865.htm t _blank 呋喃甲酸胺（celafurine），雷公藤內(nèi)酯（wilforlide）A、B，雷酚萜醇（triptonoterpenol），16-羥基雷公藤內(nèi)酯醇（16-hydroxytripto-lide），雷公藤內(nèi)酯醇即雷公藤甲素（triptolide）等成分。1.4南蛇藤及其混淆品藥理作用研究現(xiàn)發(fā)現(xiàn)南蛇藤果實(shí)水煎液及提取的粗油具有鎮(zhèn)靜催眠作用。南蛇藤根水煎液對(duì)炎癥的早晚期治療具有良好的效果，且具有一定的鎮(zhèn)痛作用。南蛇藤的提取物對(duì)大腸桿菌，流感病毒等病原微生物均有

19、明顯的預(yù)防和治療作用?，F(xiàn)臨床用于治療風(fēng)濕類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，血液病等11。且臨床研究表明南蛇藤具有一定的毒性，服用后會(huì)引起胃腸道反應(yīng)。雷公藤則具有免疫調(diào)節(jié)，抗腫瘤，改善微循環(huán)，抗炎、殺菌以及解熱鎮(zhèn)痛等作用。臨床常用于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、麻風(fēng)、紅斑狼瘡、皮肌炎、混合型結(jié)蒂組織病、干燥綜合癥、多形性紅斑、各種類(lèi)型的血管炎、酒糟鼻、與關(guān)節(jié)病性和 HYPERLINK /view/2364298.htm t _blank 膿皰型銀屑病等。其毒性遠(yuǎn)大于南蛇藤，且其中毒量與治療劑量極為相近。中毒后會(huì)出現(xiàn)眩暈，頭昏頭痛，全身疲乏，肢麻肌痛，痙攣甚而抽搐。胸悶，心悸，心痛，氣短，血壓下降，心跳減弱，心律不整，紫紺，體溫

20、下降，休克。惡心嘔吐，口干，納呆，腹脹腹痛，腹瀉或便秘，全身黃疸。上述中毒癥狀持續(xù)23日后出現(xiàn)急性腎功能衰竭，浮腫，腰痛，尿少，嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)尿毒癥而致死。1.5 DNA條形碼技術(shù)DNA條形碼（DNA barcode）是指生物體內(nèi)能夠代表該物種的、標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對(duì)較短的DNA片段。DNA條形碼已經(jīng)成為 HYPERLINK /view/1087411.htm t _blank 生態(tài)學(xué)研究的重要工具，不僅用于物種鑒定，同時(shí)也幫助生物學(xué)家進(jìn)一步了解 HYPERLINK /subview/24042/24042.htm t _blank 生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)生的相互作用。在發(fā)現(xiàn)一種未知物種或者

21、物種的一部分時(shí)，研究人員便描繪其組織的DNA條形碼，而后與國(guó)際數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)的其他 HYPERLINK /subview/13740/13740.htm t _blank 條形碼進(jìn)行比對(duì)。如果與其中一個(gè)相匹配，研究人員便可確認(rèn)這種物種的身份。 DNA條形碼技術(shù)是利用生物體DNA中一段保守片段對(duì)物種進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定的新興技術(shù)。自古以來(lái)的中藥鑒定，通常是通過(guò)中藥的性狀進(jìn)行鑒定或者一些簡(jiǎn)單的理化反應(yīng)進(jìn)行鑒定，而DNA條形碼技術(shù)則實(shí)現(xiàn)了通過(guò)生物個(gè)體、居群或物種基因中具有差異特征的DNA片段來(lái)鑒定，這有效地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)鑒定方法所受到的一些限制。其與傳統(tǒng)鑒定方法相比主要具有鑒定結(jié)果重復(fù)性優(yōu)良，鑒定方法通用性較佳，

22、可以建立統(tǒng)一的鑒定平臺(tái)和數(shù)據(jù)庫(kù)等優(yōu)點(diǎn)20。1.6 ITS2序列在 rDNA HYPERLINK /view/8563.htm t _blank 基因中，5.8S rDNA 和 28S rDNA 基因間隔序列稱為（ITS），它的長(zhǎng)度和序列變化較大，將其 HYPERLINK /view/3853396.htm t _blank 擴(kuò)增物進(jìn)行 RFLP 或序列分析，可用于對(duì)真菌的不同 HYPERLINK /view/920620.htm t _blank 生物型、 HYPERLINK /view/845922.htm t _blank 菌株、種、屬進(jìn)行分類(lèi)鑒定。甚至用于區(qū)分關(guān)系非常近的種。ITS2是真

23、核生物rDNA的一段順?lè)醋樱挥?.8S和28SrRNA之間，由于該序列具有適合擴(kuò)增和測(cè)序的長(zhǎng)度，有利于對(duì)發(fā)生降解的樣品進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí),ITS2片段在物種水平的變異較快，有更多的突變位點(diǎn)以區(qū)分不同的物種。2010年中國(guó)學(xué)者提出將ITS2作為藥用植物標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼，并psbA-trnH 作為ITS2 的補(bǔ)充序列。2 引言南蛇藤（Celastrus orbiculatus Thunb.）系衛(wèi)矛科（Celastraceae）南蛇藤屬(Celastrus L.）植物1。該屬植物入藥的有15種，如燈油藤C.Panicuatta、青江藤C.hindsii、刺南蛇藤C.flagellaris等,常用于治療

24、筋骨疼痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰腿痛、跌打損傷、癰腫瘡瘍等病癥2-10。南蛇藤作為南蛇藤藥材的基原物種常以其根入藥，治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，同屬藥用植物親緣關(guān)系近，性狀差異小，容易其與混偽。南蛇藤是有毒中藥，尚有山砒霜之稱,服用后有胃腸道反應(yīng),表現(xiàn)為輕度的胃部不適、惡心、嘔吐等，但其毒副作用比同科雷公藤屬植物雷公藤（Tripterygium wilfordii level.Hook.f.）小11。有關(guān)文獻(xiàn)記載，南蛇藤與雷公藤在市場(chǎng)上存在混用現(xiàn)象12，傳統(tǒng)的顯微鑒定，理化鑒定存在一定的局限性?？傊?，為了其臨床用藥安全、有效，有必要對(duì)南蛇藤及雷公藤藥材其進(jìn)行溯源研究。有關(guān)南蛇藤鑒別研究相對(duì)較少

25、，僅見(jiàn)性狀鑒別和顯微鑒別等13。DNA條形碼技術(shù)是利用基因組中一段公認(rèn)的、相對(duì)較短的DNA片段來(lái)進(jìn)行物種鑒定的分子生物學(xué)技術(shù)，具有快速準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單有效的特點(diǎn)，是傳統(tǒng)生物鑒定方法的有效補(bǔ)充14。Chen S L等15提出將ITS2序列作為藥用植物鑒定標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼序列得到了廣泛認(rèn)可16。應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)對(duì)物種進(jìn)行鑒定和分類(lèi)已成為生物分類(lèi)學(xué)的研究熱點(diǎn)17-18。本研究利用ITS2條形碼對(duì)南蛇藤及其混偽品進(jìn)行比較研究，旨在為該藥材的質(zhì)量控制、臨床安全用藥及合理開(kāi)發(fā)利用提供分子依據(jù)。3 實(shí)驗(yàn)材料 樣品經(jīng)中國(guó)科學(xué)院武漢藥用植物園趙子恩研究員鑒定，憑證標(biāo)本保存于湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院。實(shí)驗(yàn)樣品及來(lái)自Ge

26、nBank所下載序列，見(jiàn)表1。另包括從不同的藥材市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)南蛇藤藥材15份（HB0695MT12-26），雷公藤藥材7份（HB3250MT07-13）。表1 實(shí)驗(yàn)樣品及下載序列信息編號(hào)種名采集地樣本編號(hào)GenBank登錄號(hào)1南蛇藤Corbiculatus湖北恩施、湖北神農(nóng)架、江西廬山HB0695MT01-112顯柱南蛇藤Cstylosus湖北恩施HB0693MT01-02,HB0694MT03-04,HB0697MT06-07,JQ4241363皺果南蛇藤Ctonkinensis湖北恩施、湖北神農(nóng)架HB0692MT01-05JQ4241384苦皮藤Cangulatus湖北神農(nóng)架HB0688MT0

27、4-05EU328759-60,JQ4240975粉背南蛇藤Chypoleucus湖北神農(nóng)架HB0694MT02-03JQ424111,JQ4241226長(zhǎng)序南蛇藤Cvaniotii湖北恩施HB0699MT01-02JQ424139-1407小南蛇藤Ccuneatus湖北恩施HB0689MT01-028短梗南蛇藤Crosthornianus湖北恩施HB0696MT01EU3287629寬葉短梗南蛇藤Crosthornianus Loes.湖北恩施HB0697MT01-0210雷公藤T. wilfordii湖北恩施HB325MT02-06FJ980418, GQ434766,HM115962,

28、JQ42414811燈油藤CpaniculatusJQ424125-126,KF54489012皺葉南蛇藤CrugosusJQ424132-13313刺苞南蛇藤CflagellarisJQ424100-1014 方法4.1 DNA提取 用75%乙醇擦拭實(shí)驗(yàn)樣品表面，刮去外表皮，分別取實(shí)驗(yàn)材料的干燥葉片30 mg，用球磨儀（Retsch MM400，Germany）研磨2 min（30 次/s），然后用改良的CTAB法19提取植物總DNA。4.2 PCR擴(kuò)增及檢測(cè) 采用通用引物、反應(yīng)條件及程序?qū)侱NA進(jìn)行PCR擴(kuò)增20，PCR反應(yīng)體系以25 L為參照，包括2PCR Mix 12.5 L，引物對(duì)

29、ITS2 P3/E4(2.5 mol L-1)各1 L ，模板DNA2 L，滅菌雙蒸水8.5 L。設(shè)置未加模板DNA的PCR反應(yīng)為陰性對(duì)照。PCR程序參見(jiàn)中藥材 DNA 條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則 18。 應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，38份樣品的PCR經(jīng)電泳后均能顯示單一條帶，測(cè)序后均得到高質(zhì)量ITS2序列峰圖。 4.3 數(shù)據(jù)處理應(yīng)用CondonCode Aligner V 4.2.4（CondonCodeCo，USA）軟件對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行校對(duì)拼接，基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法去除兩端5.8S和28S區(qū)段，獲得ITS2間隔區(qū)序列21。利用MEGA（Molecular Evolut

30、ionary Genetics Analysis）6.0 進(jìn)行序列比對(duì)分析22，計(jì)算種內(nèi)、種間Kimura-2-Parameter（K2P）遺傳距離，構(gòu)建系統(tǒng)鄰接（Neighbor Joining，NJ）樹(shù)23。5 結(jié)果與分析5.1 擴(kuò)增及測(cè)序成功率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ITS2對(duì)38份基源植物樣本的擴(kuò)增及測(cè)序成功率均為100。對(duì)南蛇藤藥材的擴(kuò)增成功率為93.3%，對(duì)雷公藤藥材擴(kuò)增及測(cè)序成功率均為100。結(jié)果表明DNA在藥材中的降解度略高于基源植物。5.2 變異位點(diǎn)分析5.2.1 南蛇藤屬各藥用植物及雷公藤變異位點(diǎn)分析南蛇藤屬12種植物的序列平均長(zhǎng)度為228bp，變異位點(diǎn)多達(dá)60個(gè)，如此多的變異位點(diǎn)為其

31、準(zhǔn)確區(qū)分提供了必要條件；南蛇藤基源植物的11條序列平均長(zhǎng)度為222bp，變異位點(diǎn)數(shù)為0；雷公藤基源植物9條序列平均長(zhǎng)度為223bp，包含2個(gè)單倍型，種內(nèi)存在1個(gè)變異位點(diǎn)，各單倍型間的變異位點(diǎn)情況見(jiàn)表3。表3 南蛇藤屬部分物種及雷公藤單倍型及變異信息種名ITS2單倍型種內(nèi)變異位點(diǎn)數(shù)變異情況南蛇藤CorbiculatusJ1(11)0顯柱南蛇藤CstylosusB1(4),B2(3)135bp處C-T變異皺果南蛇藤C. tonkinensisC1(6)0苦皮藤CangulatusD1(5)0粉背南蛇藤ChypoleucusE1(4)0長(zhǎng)序南蛇藤CvaniotiiF1(4)0燈油藤Cpanicula

32、tusG1(1),G2(1),G3(1)231bp處C-T變異, 114bp處G-T變異小南蛇藤CcuneatusH1(2)0皺葉南蛇藤CrugosusK1(2)0刺苞南蛇藤CflagellarisL1(1),L2(1)43bp處T-C變異,18bp處C-A變異,57bp處A-G變異,143bp處A-T變異短梗南蛇藤CrosthornianusM1(1),M2(1)1193bp處A-G變異寬葉短梗南蛇藤Crosthornianus Loes. var.loeseneriN1(1),N2(1)1216bp處C-T變異雷公藤T.wilfordiiP1(7),P2(2)148bp處A-G變異 注:“

33、M1”等表示單倍型，“（）”內(nèi)數(shù)字表示該單倍型序列條數(shù)。5.2.2 南蛇藤屬種間及種內(nèi)遺傳距離分析南蛇藤屬各物種K2P距離數(shù)據(jù)見(jiàn)表4，南蛇藤屬內(nèi)，除短梗南蛇藤、寬葉短梗南蛇藤和顯柱南蛇藤的種內(nèi)最大K2P距離（分別為0.0046,0.0046，0.0046）大于種間最小K2P距離（分別為0，0，0.0330），樣品中的其他物種均是種內(nèi)最大遺傳K2P小于其與其他物種種間最小K2P距離。表4 南蛇藤屬種內(nèi)及南蛇藤屬各物種與其它物種種間遺傳距離物種名拉丁名種內(nèi)K2P距離(平均)與種間其它物種K2P距離(平均)南蛇藤Corbiculatus000000.0234-0.0728(0.0508)顯柱南蛇藤C

34、stylosus0.0000-0.0046(0.0022)0.0330-0.0728(0.0519)皺果南蛇藤C. tonkinensis000000.0523-0.0880(0.0675)苦皮藤Cangulatus000000.0673-0.0938(0.0770)粉背南蛇藤Chypoleucus000000.0234-0.0731(0.0449)長(zhǎng)序南蛇藤Cvaniotii000000.0046-0.0884(0.0547)燈油藤Cpaniculatus0.0046-0.0092(0.0061)0.0426-0.0781(0.0609)小南蛇藤Ccuneatus000000.0281-0.

35、0935(0.0599)皺葉南蛇藤Crugosus000000.0046-0.0938(0.0573)刺苞南蛇藤Cflagellaris0.01860.0473-0.0882(0.0606)短梗南蛇藤Crosthornianus0.00460.0000-0.0834(0.0538)寬葉短梗南蛇藤Crosthornianus Loes. var.loeseneri0.00460.0000-0.0887(0.0547)5.2.3 南蛇藤與雷公藤遺傳距離分析南蛇藤與雷公藤K2P距離數(shù)據(jù)見(jiàn)表5，南蛇藤、雷公藤的種內(nèi)最大K2P距離（分別為0.0000,0.0046）均小于南蛇藤與雷公藤種間最小K2P距離

36、( 0.0884)?；谝陨线z傳距離分析南蛇藤能與同屬其它藥用植物以及雷公藤很好的區(qū)分開(kāi)。表5 南蛇藤與雷公藤遺傳距離K2P距離比較K2P距離(平均)南蛇藤種內(nèi)0.0000雷公藤種內(nèi)0.0000-0.0046(0.0018)南蛇藤與雷公藤種間0.0884-0.0938(0.0896)5.3 鑒定市場(chǎng)供應(yīng)的商品藥材南蛇藤與雷公藤?gòu)牟煌乃幉氖袌?chǎng)購(gòu)買(mǎi)南蛇藤藥材15份（HB0695MT12-26）,雷公藤藥材7份（HB3250MT07-13），運(yùn)用改良的CTAB法獲取各自的ITS2序列（HB0695MT26未能獲得其ITS2）序列，將測(cè)序剪切后的ITS2序列導(dǎo)入NCBI鑒定（ HYPERLINK /

37、Blast.cgi/）進(jìn)行初步比對(duì)鑒定，比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表6 /Blast.cgi/）進(jìn)行初步比對(duì)鑒定，比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果表明14份南蛇藤藥材樣品中，共有9份比對(duì)為南蛇藤，而HB0695MT13、20比對(duì)為硬毛南蛇藤；HB0695MT18比對(duì)為苦皮藤；HB0695MT23比對(duì)為云實(shí)科云實(shí)屬喙莢云實(shí)；HB0695MT24比對(duì)為雷公藤。7份雷公藤藥材樣品中，共2份比對(duì)為雷公藤，另有5份（HB3250MT09-13）比對(duì)為苦皮藤，比對(duì)相似度均大于99%表6 南蛇藤、雷公藤藥材信息及ITS2序列比對(duì)結(jié)果藥材名藥材編號(hào)藥材來(lái)源比對(duì)結(jié)果相似度南蛇藤HB0695MT12；16-17湖北Celastrus orb

38、iculatus99%南蛇藤HB0695MT15；21東北Celastrus orbiculatus99%南蛇藤HB0695MT14；25安徽亳州Celastrus orbiculatus99%南蛇藤HB0695MT22云南Celastrus orbiculatus99%南蛇藤HB0695MT18四川Celastrus angulatus100%南蛇藤HB0695MT19四川Celastrus orbiculatus99%南蛇藤HB0695MT13；20東北；廣西Celastrusstylosus99%南蛇藤HB0695MT23東北Caesalpinia minax100%南蛇藤HB0695M

39、T24湖北Tripterygiumwilfordii100%雷公藤HB3250MT07；08安徽亳州；湖北Tripterygiumwilfordii100%雷公藤HB3250MT09-13安徽亳州；貴州Celastrus angulatus100%5.4 系統(tǒng)發(fā)育鄰接樹(shù)分析 根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果，將市場(chǎng)收集的14份南蛇藤藥材和7份雷公藤藥材的ITS2序列與前文已獲得的基原物種的ITS2序列一起構(gòu)建鄰接（NJ）樹(shù)（見(jiàn)圖1）。通過(guò)NJ樹(shù)結(jié)果可看出，在14份南蛇藤藥材樣品ITS2序列中，9份與南蛇藤聚為一支,1份與雷公藤聚為一支,另外4份聚到其它支。7份雷公藤藥材樣品中，2份與雷公藤聚為一支，5份與苦皮

40、藤聚為一支，NJ樹(shù)鑒定結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果一致。圖1 基于ITS2序列構(gòu)建的市場(chǎng)收集的南蛇藤、雷公藤藥材和已知基原物種鄰接（NJ）樹(shù)（注：Bootstrap 1000次重復(fù)，枝上僅顯示自展支持率50%的數(shù)值?！啊北硎纠坠倩锓N樣品；“*”表示南蛇藤基原物種樣品；“&”表示南蛇藤藥材：“+”表示雷公藤藥材；其余均為基原物種樣品）6 討論本研究首次使用DNA條形碼檢測(cè)市場(chǎng)供應(yīng)藥材南蛇藤與雷公藤。所有的基原物種樣本經(jīng)過(guò)權(quán)威專(zhuān)家鑒定，且所有的ITS2序列真是可靠，因此我們構(gòu)建了南蛇藤屬以及雷公藤DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)用于種內(nèi)和種間遺傳距離分析。結(jié)果表明南蛇藤與南蛇藤屬其他藥用植物種間最小K2P距離大于

41、南蛇藤種內(nèi)最大K2P距離，且NJ樹(shù)顯示南蛇藤、雷公藤各自單獨(dú)聚為一支，驗(yàn)證了最小距離法的結(jié)論；另外，在南蛇藤同屬藥用植物中，除短梗南蛇藤與寬葉短梗南蛇藤，長(zhǎng)序南蛇藤與皺葉南蛇藤外，其他物種均各自聚為一支，能很好的區(qū)分開(kāi)，證明了ITS2序列作為DNA條形碼的通用性，且在南蛇藤同屬藥用植物中有較好的鑒定能力。中藥材的真?zhèn)?，?yán)重威脅著臨床用藥質(zhì)量安全和有效，關(guān)系到中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展，必須引起高度重視。正品藥材缺乏以及藥材種植的不規(guī)范性使得藥材市場(chǎng)混亂18，中藥材摻偽的問(wèn)題依然嚴(yán)重，尋求更有效的手段解決摻偽問(wèn)題十分必要。本研究從市場(chǎng)上隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)15份南蛇藤藥材和7份雷公藤藥材，通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲取的ITS2序列分

42、別為14條和7條，經(jīng)與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)鑒定，并結(jié)合已知基原物種序列建立NJ樹(shù)從而確定其真?zhèn)?，結(jié)果表明，從14份南蛇藤藥材ITS2序列中檢測(cè)出9個(gè)正品和5個(gè)混偽品，7份雷公藤藥材ITS2序列中檢測(cè)出2個(gè)正品和5個(gè)偽品，并且發(fā)現(xiàn)南蛇藤中混有雷公藤，該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)藥材市場(chǎng)供應(yīng)的南蛇藤、雷公藤藥材的快速、準(zhǔn)確鑒定，同時(shí)證實(shí)了ITS2序列作為藥材可追溯技術(shù)的可靠性。7 結(jié)論本研究基于ITS2序列進(jìn)行藥材南蛇藤的溯源研究，并檢測(cè)市場(chǎng)供應(yīng)的南蛇藤、雷公藤藥材是否存在混偽品，結(jié)果證明，ITS2序列不僅能成功區(qū)分南蛇藤同屬藥用植物，還能鑒別南蛇藤與其混偽品雷公藤，且建立的南蛇藤藥材ITS2可追溯技術(shù)能實(shí)現(xiàn)對(duì)市場(chǎng)供應(yīng)的

43、藥材南蛇藤、雷公藤的真?zhèn)闻卸ā槟仙咛偻瑢偎幱弥参镆约袄坠俚蔫b定提供了分子依據(jù)，保障其臨床用藥的安全、有效。參考文獻(xiàn)1中國(guó)科學(xué)院植物志編輯委員會(huì),中國(guó)植物志M.45卷第3分冊(cè).北京:科學(xué)出版社,1999.2馮衛(wèi)生,郝志友,鄭曉坷.南蛇藤屬藥用植物化學(xué)成分研究進(jìn)展J.中國(guó)新藥雜志,2007,16(9):672-677.3Huag HC, Shen CC, Chen CF, et al. A novel agarofuran sesquiterpene , celahin D from Celastrus hindsii BenthJ. Chemical Pharmaceutical Bulle

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