細胞培養(yǎng)復(fù)習(xí)題VIP

1、名稱解釋細胞培養(yǎng)（動物細胞培養(yǎng)）：動物細胞培養(yǎng)是指將動物活體體內(nèi)取出的組織用機械或消化的方法分散成單細胞懸液，然后放在類似于體內(nèi)生存環(huán)境的體外環(huán)境中，進行孵育培養(yǎng)，使其生存、生長并維持其結(jié)構(gòu)與功能的方法。組織培養(yǎng)：從生物體內(nèi)取出活的組織（多只組織塊）在體外進行培養(yǎng)的方法。有時泛指所有的體外培養(yǎng)。器官培養(yǎng)：是將活體內(nèi)的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在體外進行培養(yǎng)的方法。合成培養(yǎng)基：根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的、配方恒定的培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基：由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補充因子（生長因子和激素、結(jié)合蛋白等）組成。完全培養(yǎng)基：在合成培養(yǎng)基里添加血清后的培養(yǎng)基。

2、接觸抑制：體外培養(yǎng)的細胞在貼附底物上連接成片、相互接觸后失去運動的現(xiàn)象。無限細胞系：細胞株傳代至50代后又出現(xiàn)細胞生長停滯狀態(tài)，只有部分細胞由于遺傳物質(zhì)的改變，使其在培養(yǎng)條件下可以無限制傳代，這種傳代細胞為細胞系。去分化（脫分化）：細胞在體外不可逆地失去原有特性。注意：去分化不意味分化能力完全喪失！在適當(dāng)調(diào)節(jié)信號刺激下仍能表現(xiàn)出分化特性。但分化能力會隨培養(yǎng)時間延長而逐漸喪失。不適應(yīng)：各種分化細胞，在體外培養(yǎng)時逐漸失去各自的形態(tài)與功能特征，表現(xiàn)出某種趨同性。原因：培養(yǎng)條件變化使分化發(fā)生阻抑細胞分裂指數(shù)（MI）：是指細胞群中每1000個細胞中的分裂相數(shù)量細胞群體倍增時間：是指培養(yǎng)物中細胞數(shù)量翻倍的

3、時間。原代培養(yǎng)：從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞為原代細胞。培養(yǎng)的第1代細胞與傳10代以內(nèi)的細胞稱為原代細胞培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：將原代細胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。1）體外培養(yǎng)細胞，其生長方式主要有貼壁生長和懸浮生長兩種，分別稱為貼壁細胞和懸浮細胞。2）一般可將貼壁細胞生長的體外培養(yǎng)細胞大體分為成纖維細胞型、上皮細胞型、游走細胞型、多行細胞型四種類型，最常見的為前兩種。3）體外培養(yǎng)細胞的主要生長特點：貼附生長接觸抑制密度依賴性 培養(yǎng)細胞分化狀態(tài)的變化：去分化（脫分化）不適應(yīng)1、細胞培養(yǎng)的基本要求有哪些和工作方法要求：1）培養(yǎng)前準(zhǔn)備2）操作間消

4、毒3）洗手和著裝4）火焰消毒培養(yǎng)前的準(zhǔn)備的基本要求：培養(yǎng)基的選擇和無菌配制動物細胞培養(yǎng)用液的類型、配制和無菌處理方法：1）操作程序規(guī)范2）試劑設(shè)備專人負責(zé)3）培養(yǎng)用品定點存放2、平衡鹽溶液（BBS）：（1）成分：無機鹽和葡萄糖，少量酚紅。（2）作用：維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)酸堿度（3）常用：Hanks液、PBS等 消化液（1）作用：分散組織或細胞團。2）常用：胰蛋白酶消化液、膠原酶消化液、EDTA-2Na液、蝸牛酶等2、消化液中的胰蛋白酶消化液、膠原酶消化液、EDTA-2Na液作用的原理是什么？胰蛋白酶消化液主要作用是水解細胞之間的蛋白質(zhì)，使細胞相互分離。EDTA-2Na液：是一種化學(xué)螯合劑，其

5、溶液又稱Versen液，對細胞有一定的離解的作用。EDTA-2Na液的主要作用是通過結(jié)合（螯合）細胞間質(zhì)中的二價陽離子從而破壞細胞之間的細胞連接。達到分散細胞的目的。膠原酶溶液：膠原酶是從細胞中提取的一種酶，對膠原組織和細胞間質(zhì)有較強的消化作用，而對培養(yǎng)細胞一般不產(chǎn)生損傷，常在上皮類細胞原代培養(yǎng)時用來離散細胞與膠原組織。3、1）天然培養(yǎng)基：定義:主要指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。優(yōu)點：含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，滲透壓、pH等也與體內(nèi)環(huán)境相似，培養(yǎng)效果好。缺點：成分復(fù)雜，批間差異大，易被支原體污染。2）合成培養(yǎng)基：根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用

6、人工方法模擬合成 的，配方恒定的培養(yǎng)基。 成分：氨基酸、維生素、碳水化合物、無 機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量固定。成本低。 缺點： 缺少某些成分，不能促進細胞增殖生長。3）完全培養(yǎng)基;定義：在合成培養(yǎng)基里添加血清后的培養(yǎng)基。細胞生長培養(yǎng)基:常用培養(yǎng)基，血清含量高, 10-20%。維持培養(yǎng)基:維持細胞不死或緩慢生長，血清含量低, 2-5%。4）無血清培養(yǎng)基：定義：由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補充因子（生長因子和激素、結(jié)合蛋白等）組成。用途：用于研究細胞生長因子、單克隆抗體制備、細胞分泌產(chǎn)物研究等。優(yōu)點：保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，減少細胞污染，簡化提純和鑒定等程序

7、。 3、完全培養(yǎng)基中各成分的作用是什么？ 合成培養(yǎng)基（基礎(chǔ)培養(yǎng)基）的成分只能維持細胞生存血清：常用牛血清，含有促進細胞增殖的各種生長因子和其他多種有利于細胞生存的物質(zhì)。一定量的抗生素：防止污染 4、體外培養(yǎng)細胞與體內(nèi)培養(yǎng)細胞的差異都有哪些？5、論述培養(yǎng)細胞的一代生存期可分為幾個階段及其特點？培養(yǎng)細胞的“一代生存期”，是指從細胞接種后到再次傳代培養(yǎng)之前的這一段時間，它與細胞世代或倍增時間不同?？煞譃闈摲凇⒅笖?shù)生長期、停滯期（平頂期）1.潛伏期特點：1）細胞適應(yīng)新環(huán)境的恢復(fù)期（包括懸浮期、貼壁期、潛伏期三個時期）2）可有運動活動，基本無增殖，少見分裂相。2.指數(shù)生長期特點：1）細胞增殖最旺盛的時

8、期，細胞數(shù)量呈指數(shù)生長，是實驗研究和生產(chǎn)的主要階段。2）用細胞分裂指數(shù)和細胞群體倍增時間表示。3.停滯期特點：特點：細胞數(shù)量不再增加，仍有代謝活動6、動物細胞培養(yǎng)具有一系列優(yōu)點：可簡化細胞的生長環(huán)境。在細胞存活的基礎(chǔ)上獨立研究細胞生命活動、逐項研究細胞生存條件和細胞功能。能夠方便地控制實驗因素。 研究某種實驗因素對細胞的生物學(xué)作用，只需在培養(yǎng)液中有針對性地加入或者刪除這種成分。易于觀測實驗結(jié)果。利用細胞培養(yǎng)技術(shù)研究細胞的生命活動規(guī)律，可以很方便地采用各種實驗技術(shù)和方法來觀察、檢測和記錄。可供研究的細胞種類極其廣泛?？赏瑫r提供大量均一性較好的細胞群，降低實驗成本。能夠進行大規(guī)模生物制品的生產(chǎn)。包

9、括酶、單克隆抗體以及多種疫苗等生物制品或者基因工程產(chǎn)品。2、動物細胞培養(yǎng)的缺點：體外培養(yǎng)的動物細胞對營養(yǎng)的要求較高。動物細胞生長緩慢，對環(huán)境條件要求嚴(yán)格。體外培養(yǎng)的細胞與體內(nèi)生長的細胞存在或多或少的差異。（形態(tài)和功能的差異）7.動物細胞培養(yǎng)實驗室有哪幾個部分組成？理想的培養(yǎng)實驗室可分為：準(zhǔn)備室、緩沖室（與培養(yǎng)室相連的消毒房間，作為隔離培養(yǎng)室與外面非消毒房間的緩沖地帶）、培養(yǎng)室（一間或幾間），普通實驗室、辦公室。8.論述細胞培養(yǎng)的生長特點。培養(yǎng)細胞生命期：指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。包括三個階段：原代培養(yǎng)期、傳代培養(yǎng)期、衰退期。1.原代培養(yǎng)期 （也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第

10、一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周） 特點：二倍體，細胞分裂次數(shù)少，異質(zhì)性，獨立生存性差。 用途：藥物測試，疫苗制備等。2.傳代培養(yǎng)期（定義：原代細胞接種到兩個或以上的器皿繼續(xù)進行培養(yǎng)標(biāo)志進入傳代培養(yǎng)期）特點：細胞分裂增殖旺盛，去分化，在全生命期中此期的持續(xù)時間最長，傳代10-50次。3.衰退期（定義：傳代培養(yǎng)一定代數(shù)后，細胞生命活動明顯減弱，增殖很慢或不增殖，直至衰退死亡的時期。）細胞特點：細胞形態(tài)輪廓增強，色澤變暗，細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)暗的顆粒樣結(jié)構(gòu)及空泡狀結(jié)構(gòu)，胞質(zhì)突起回縮，最后衰退凋亡。9.論述玻璃制品清洗步驟10、論述動物細胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用1.在生物學(xué)領(lǐng)域基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用（1）在細胞生物學(xué)上的應(yīng)

11、用 研究細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生長發(fā)育、細胞營養(yǎng)、代謝以及病變等微觀過程。（2）在遺傳學(xué)上的應(yīng)用 染色體分析，雜交育種。（3）在胚胎學(xué)上的應(yīng)用 通過體外培養(yǎng)卵母細胞，進行體外受精、胚胎分割和移植。（4）在病毒學(xué)上的應(yīng)用 培養(yǎng)細胞為病毒的增殖提供場所。（5）在藥理學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用 藥品、食品添加劑等對機體的毒性及其產(chǎn)生不良影響的安全性調(diào)查。（許多致畸、致癌物質(zhì)加入動物細胞培養(yǎng)液后，培養(yǎng)細胞會發(fā)生染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的變異。）2.在臨床醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用（1）用于遺傳疾病和先天畸型的產(chǎn)前診斷 用羊膜穿刺技術(shù)獲得胎兒細胞，培養(yǎng)后進行染色體分析，診斷胎兒是否患有遺傳性疾病或先天畸型。（2）用于癌癥的早期診斷和預(yù)防 通過

12、培養(yǎng)淋巴細胞，對其染色體進行對比分析檢測出易患癌癥的病人，進行及早的預(yù)防和治療。（3）用于臨床治療 目前已有將正常骨髓細胞經(jīng)大量培養(yǎng)后植入患造血障礙癥患者體內(nèi)進行治療的報道。（4）用于藥物效應(yīng)的檢測 檢測的藥物具有組織特異性時，可選用相應(yīng)的細胞，如檢測治療肝病的藥物可選用肝細胞、檢測抗癌藥物可選用癌細胞。3.在動物育種上的應(yīng)用 新品種的培育可大大縮短育種進程，且更加經(jīng)濟有效。胚胎干細胞的研究成果和克隆羊多莉的問世為動物遺傳育種開辟了一條新途徑。4.在生物制品生產(chǎn)上的應(yīng)用 用動物細胞可生產(chǎn)的生物制品有各類疫苗、干擾素、激素、酶、生長因子、病毒殺蟲劑、單克隆抗體等。11、血清種類：人血清、牛血清、

13、馬血清等。成分：基本營養(yǎng)物、激素、生長因子、結(jié)合蛋白、貼壁和擴展因子等。標(biāo)準(zhǔn): 透明,淡黃色,無沉淀物,無細菌、支原體、病毒污染。 使用：逐步解凍，熱滅活， 10%濃度，超低溫保存。牛血清又分胎牛血清和小牛血清，它們的區(qū)別胎牛血清是從母牛剖腹取出的胎牛中分離出來的血清，對許多細胞系均有促進生長作用，主要用于細胞株的保藏及特殊嬌貴細胞株的體外培養(yǎng)，但價格昂貴。小牛血清是從剛出生但尚未哺乳的小牛分離出來的血清。12、細胞傳代方法貼壁細胞的消化法傳代步驟（1）吸出或倒掉瓶內(nèi)的舊培養(yǎng)液。（2）加入適量的消化液消化。（3）鏡檢，發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大后，應(yīng)立即終止消化。（4）吹打瓶壁細胞，制成細胞

14、懸液。（5）計數(shù)，接種到新的培養(yǎng)瓶。懸浮細胞多采用離心法傳代將細胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，800-1000rpm離心5min,然后取出上清，加入新的培養(yǎng)液到離心管內(nèi)，用吸管吹打使之形成細胞懸液，然后傳代接種。13、培養(yǎng)細胞的觀察和檢測技術(shù)1）培養(yǎng)液 觀察培養(yǎng)液的顏色和透明度的變化。 正常培養(yǎng)液pH介于7.27.4之間，呈桃紅色、清亮透明。培養(yǎng)中細胞代謝產(chǎn)生的酸性產(chǎn)物會使培養(yǎng)液pH值下降，引起顏色變淺變黃。23天或34天換液一次。2）細胞生長狀況 倒置顯微鏡觀察。原代細胞培養(yǎng)中最先可見從組織塊中邊緣“長出”細胞。成纖維細胞是最易生長的細胞。細胞長滿瓶底80%應(yīng)及時傳代。3、細胞形狀變化 生

15、長良好的細胞：透明度大，折光性強，輪廓不清。細胞生長狀態(tài)不良的細胞：輪廓增強，細胞折光性變?nèi)?，邊緣不齊，胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡、脂滴、顆粒狀物質(zhì)，細胞之間空隙增大，細胞表面及周圍出現(xiàn)絲絮狀物。采取措施：換液、排污、廢棄。4、微生物污染細菌污染：培養(yǎng)液渾濁、漂浮菌絲。支原體污染：生長減緩、胞質(zhì)顆粒增多、培養(yǎng)液不變混。細胞交叉污染?；瘜W(xué)物質(zhì)污染。14、去分化和不適應(yīng)的區(qū)別“去分化”不可逆（染色體變化）?！安贿m應(yīng)”可重新誘導(dǎo)（培養(yǎng)條件變化）關(guān)于去分化需要注意： 去分化并不意味著完全返回胚胎時期的原始細胞狀態(tài)。如:高度分化的神經(jīng)細胞和心肌細胞已經(jīng)喪失的增生活性不可能恢復(fù)，但已經(jīng)具備的生物電活動特性不會完全失去

16、 ?？芍匦卤憩F(xiàn)出分化特點。 如：把表皮細胞放在氣液界面上培養(yǎng)，可分化成含大量角蛋白絲的角質(zhì)細胞 、內(nèi)皮細胞，但，這種能力會隨著培養(yǎng)時間延長逐漸喪失。15、谷氨酰胺在培養(yǎng)基中的主要作用？配液時應(yīng)該注意哪些問題？作用：在細胞代謝中有重要作用，是細胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需氨基酸，（在缺少時，細胞生長不良死亡）配液時：由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應(yīng)置于-20度冰箱中保存，在使用前加入培養(yǎng)液內(nèi)。已含谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4度冰箱中儲存2周以上時，還應(yīng)重新加入原來的谷氨酰胺。第二章1、細胞冷凍的原理是什么細胞凍存的原則：慢凍快融 2）加冷凍保護劑（常用：甘油或二甲基亞砜（DMSO)）主要原因：1）冷凍速度過快

17、，細胞內(nèi)水分結(jié)冰形成冰晶，造成細胞膜和細胞器的破壞引起細胞死亡。冷卻速度越快，冰晶損傷越大。2）細胞懸浮在溶液中，隨著溫度的下降，細胞外部的水分會先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)的濃度升高。如果將細胞暴露在這樣高溶質(zhì)的溶液中且時間過長，細胞膜上脂質(zhì)會受到損壞，細胞便發(fā)生滲漏。冷凍保護劑作用機理：1）冷凍保護劑易同溶液中水分子結(jié)合，從而降低冰點，減少冰晶的形成 ；2）通過其摩爾濃度降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細胞免受溶質(zhì)的損傷，細胞得以在超低溫條件下保存。2、復(fù)蘇原理復(fù)蘇時融解細胞速度要快，使之迅速通過細胞最易受損的-50度，這樣可以保證細胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使

18、水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損害，以防止細胞內(nèi)形成冰晶引起細胞死亡。3、細胞復(fù)蘇的過程將恒溫水浴箱的溫度調(diào)至3740。從液氮中取出凍存小管，立即投入3740溫水中快速晃動，直至凍存液完全融解。要在12min內(nèi)完成復(fù)溫。將細胞凍存懸液移入離心管，加入約5m1培養(yǎng)液，輕輕吹勻。 將細胞懸液經(jīng)8001000 r/min離心5min。棄上清液。給細胞沉淀物加入完全培養(yǎng)液，輕輕吹吸均勻。將細胞懸液移入培養(yǎng)瓶內(nèi)，加培養(yǎng)液37、5%CO2培養(yǎng)。4、細胞活性檢查1.染色法：使損傷或死亡細胞著色。結(jié)晶紫、臺盼藍、苯胺黑等。2.四唑鹽（MTT）比色法：活細胞可沉淀四唑鹽并形成藍紫色結(jié)晶，再用DMSO溶解

19、結(jié)晶物，溶液顏色的深淺與所含的甲躦量成正比。用酶標(biāo)儀在5 7 0nm波長處測定其吸光度OD值，可間接反映活細胞數(shù)。第三章1、原代細胞培養(yǎng)常用組織塊培養(yǎng)法和消化培養(yǎng)法。2、組織塊培養(yǎng)法 定義：組織塊培養(yǎng)是即將組織剪切成小塊后，接種于培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的方法?；痉椒ǎ簩⒓舫傻男〗M織團塊接種于培養(yǎng)瓶（或皿）中，瓶壁可預(yù)先涂以膠原薄層，以利于組織塊粘著于瓶壁，使周邊細胞能沿瓶壁向外生長。特點：操作簡便，組織塊易損傷，細胞生長緩慢，適于組織量少的原代培養(yǎng)?；具^程：取材修剪沖洗；剪成1mm3左右的小塊；移入培養(yǎng)瓶；間距5mm分布組織小塊；翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶37靜止2-4h；翻正培養(yǎng)瓶培養(yǎng)；原代細胞培養(yǎng)。3、消化培養(yǎng)法

20、定義：利用組織消化分散法將細胞間質(zhì)物質(zhì)去除，使細胞分散，形成懸液培養(yǎng)的方法。特點：容易獲得大量細胞，生長速度快，適于培養(yǎng)大量組織，但步驟繁瑣，易污染，實驗費用高。過程：消化分離法消化細胞、鏡檢；發(fā)現(xiàn)組織已分散成細胞團或單個細胞，終止消化，篩網(wǎng)過濾，大塊繼續(xù)消化；過濾的消化液，低速離心，加培養(yǎng)液，細胞計數(shù)后，接入培養(yǎng)瓶。4、原代取材的基本要求（1）無菌取材：嚴(yán)格無菌操作。（2）取材器械鋒利：防止機械損傷。（3）及時培養(yǎng)：可培養(yǎng)液4暫存。（4）去除無用組織，避免干燥。（5）營養(yǎng)豐富：添加10%血清。（6）采用易培養(yǎng)組織：組織類型、分化程度、年齡等。（7）作好記錄：來源等信息及標(biāo)本要保留。5、組織材

21、料的分離1) 細胞懸液的分離方法 來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，可采用離心法分離。一般采用50001000r/min的低速離心510分鐘。2)組織材料的分離方法 可采用機械分散法（物理裂解）和消化分離法。1.機械分散法 方法:注射針芯擠壓法。 特點:簡便、快速,但對組織機械損傷大，而且細胞分散效果差,適用于處理纖維成分少的軟組織。2.剪切分散法 利用剪切法將組織剪切成1平方毫米的小塊。3.消化分離法 定義：消化法是結(jié)合生化和化學(xué)手段把已剪切成較小體積的組織進一步分散的方法。 種類：胰蛋白酶法、膠原酶法、EDTA法。6、應(yīng)用體外培養(yǎng)技術(shù)進行中瘤研究具有的優(yōu)點1，可以免受機體內(nèi)部因素的影響

22、，從而便于研究理化和生物等因素對腫瘤細胞生命的影響2、便與研究腫瘤細胞的結(jié)構(gòu)和功能3、腫瘤細胞可長期保存以便觀察其遺傳行為的變化4、可用抗癌藥物的快速篩選7、腫瘤細胞培養(yǎng)生物學(xué)特性：永生性、侵襲性，不受控增殖性，遺傳性質(zhì)改變，異質(zhì)性、成瘤性。第四章動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)：指在人工條件下，在細胞生物反應(yīng)器中高密度大量培養(yǎng)動物細胞用于生產(chǎn)生物制品的技術(shù)微載體：微載體指直徑在60250微米，能適用于細胞貼壁培養(yǎng)的微珠，一般由葡聚糖或各種合成聚合物組成。中空纖維培養(yǎng)技術(shù)：模擬細胞在體內(nèi)生長的三維狀態(tài)，利用中空纖維給培養(yǎng)細胞提供物質(zhì)代謝條件而建立的一種大規(guī)模培養(yǎng)方法微囊化培養(yǎng)是指在無菌條件下將擬培養(yǎng)的細

23、胞、生物活性物質(zhì)以及生長介質(zhì)共同包裹在薄的半透膜中形成微囊，再將微囊放入培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)進行培養(yǎng)的方法。1、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法 1.貼壁培養(yǎng)2.固定化培養(yǎng)3.懸浮培養(yǎng)（一）貼壁培養(yǎng)定義：指細胞貼附在一定的固相表面進行的培養(yǎng)方式。優(yōu)點：適用細胞種類多；容易采用灌流培養(yǎng)；容易更換培養(yǎng)液。缺點：操作比較復(fù)雜，需要合適的貼附材料和足夠的面積，培養(yǎng)條件不易均一，傳質(zhì)和傳氧較差，投資大。培養(yǎng)方式：旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)、中空纖維培養(yǎng)、細胞工廠培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)。（二）固定化培養(yǎng)定義：將動物細胞與水不溶性載體結(jié)合起來進行培養(yǎng)的方式。優(yōu)點：既適用于貼壁依賴性細胞，又適用于非貼壁依賴性細胞的包埋培養(yǎng)，細胞密度高，抗剪切力和抗

24、污染力強，易于分離純化。方法：吸附法、包埋法、微囊法（三）懸浮培養(yǎng)定義：指細胞在生物反應(yīng)器中自由懸浮生長的培養(yǎng)方法。優(yōu)點：操作簡單、培養(yǎng)條件均一、傳質(zhì)和傳氧比較好，容易擴大培養(yǎng)規(guī)模，可借鑒細菌發(fā)酵的經(jīng)驗。缺點：體積小，較難采用灌流培養(yǎng)。常用反應(yīng)器為攪拌式和氣升式。2、微載體的選擇有何要求微載體表面性質(zhì)與細胞有良好的相容性，適用細胞附著、伸展和增殖；微載體無毒、惰性，不與培養(yǎng)基成分發(fā)生化學(xué)變化，也不會吸收培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分；微載體的比重在1.0301.045g/ml，使載體在低速攪拌下就可懸浮，而在靜止時又可很快沉降，便于換液和收獲；粒徑在60250m（溶脹后）之間，均一，差異不大于20 m 。

25、有利于細胞均勻分布在各微載體表面；具有良好的光學(xué)透明性，利于觀察細胞在載體上的生長情況；可耐120高溫，便于采用高壓蒸汽滅菌； 原料充足，價廉，制備簡便，經(jīng)簡單的適當(dāng)處理后，可反復(fù)多次地使用。3、微載體培養(yǎng)的操作包括哪些步驟培養(yǎng)初期階段；粘附貼壁階段；維持培養(yǎng)階段；細胞收獲階段；微載體培養(yǎng)放大階段4、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用5、微囊化培養(yǎng)中微囊的制備應(yīng)注意哪些問題1）溫和、快速、不損傷細胞，盡量在液體和生理條件下操作2）所用試劑和膜材料對細胞無毒害3）膜的孔徑可控制，必須使?fàn)I養(yǎng)物和代謝物自由通過4）膜應(yīng)有足夠機械強度抵抗培養(yǎng)中的攪拌。6、理想的動物細胞生物反應(yīng)器應(yīng)滿足哪些基本要求？使比較教材所介紹

26、的幾種生物反應(yīng)器各自優(yōu)缺點能提供充足氧氣；良好的傳質(zhì)傳熱及密閉性能；制備材料對細胞無毒；有自動檢測調(diào)控系統(tǒng)；便于操作維護。1、攪拌式細胞生物反應(yīng)器 優(yōu)點：避免向培養(yǎng)基直接通氣時氣泡損傷細胞，沒有移動部件，密封好，氧轉(zhuǎn)換率較高，便于放大。 缺點：氧傳遞系數(shù)小，氣路系統(tǒng)不能就地滅菌。2、氣升式動物細胞培養(yǎng)反應(yīng)器 優(yōu)點:器內(nèi)氣流溫和均勻剪切力小，完全密封，便于無菌操作，氧的轉(zhuǎn)換率高，便于放大生產(chǎn) 缺點：1）這種生物反應(yīng)器只能用于需要氣體的反應(yīng)，或者是需要有氣體的場合2）在培養(yǎng)細胞的過程中會產(chǎn)生大量的氣泡，從而會對正在培養(yǎng)的細胞的生長產(chǎn)生影響3）這種生物反應(yīng)器，如果沒有其他裝置的幫助就只能培養(yǎng)懸浮生長

27、的細胞。3、中空纖維細胞培養(yǎng)反應(yīng)器 優(yōu)點1）培養(yǎng)器體積小，細胞高細胞損害小；2）濃縮產(chǎn)品；3）易于分離產(chǎn)物，產(chǎn)物純度高，不易污染；4）自動化程度高，細胞生長周期長。 缺點:細胞生長速度慢，代謝物容易堵塞孔徑，不易清洗維護，價格高第五章抗原上可以引起機體產(chǎn)生抗體的分子結(jié)構(gòu)，叫做抗原決定簇?？贵w：是指機體受抗原刺激后產(chǎn)生的能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合具有免疫功能的球蛋白。單克隆抗體：即單個B淋巴細胞克隆所分泌的抗體。是將抗體產(chǎn)生細胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細胞成為純一的單克隆細胞系而產(chǎn)生的。多克隆抗體：一個抗原上可以有好幾個不同的抗原決定簇，進入機體后會刺激好

28、幾中B細胞增殖，因而使機體產(chǎn)生幾種不同的抗體，成為多克隆抗體基因轉(zhuǎn)染技術(shù)：將外源性基因采用化學(xué)或物理的方法人工導(dǎo)入細胞的技術(shù)。主要用于癌基因研究。1、 什么是單克隆抗體？其特性和局限性如何？與多克隆抗體有何異同？單克隆抗體是由一種B細胞克隆所產(chǎn)生的只針對某一特定抗原決定簇的抗體分子。局限性：固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應(yīng)用范圍；反應(yīng)強度不如多克隆抗體；制備技術(shù)復(fù)雜，費時費工，價格較高。特性：理化性狀高度均一、生物活性單一、與抗原結(jié)合的特異性強，便于人為處理和質(zhì)量控制不同：單克隆抗體的特異性強，只針對單一的抗原表位；而多克隆抗體則可以與多個抗原表位結(jié)合，當(dāng)抗原的某個抗原表位改變時，單抗

29、不能發(fā)揮其作用2、簡述單克隆抗體的制備流程和應(yīng)用。應(yīng)用：1）用于疾病的診斷和治療：2）作為載體制備導(dǎo)向藥物。3、骨髓瘤細胞和脾細胞融合過程中應(yīng)特別注意的幾個問題是什么1)細胞比例2）反應(yīng)時間3）反應(yīng)溫度4）PEG的選擇4、雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體的基本原理1）要制備單克隆抗體需先獲得能合成專一性抗體的單克隆B淋巴細胞，但B淋巴細胞不能在體外生長。2）而骨髓瘤細胞可在體外生長繁殖，應(yīng)用細胞雜交技術(shù)使骨髓瘤細胞與免疫的淋巴細胞融合，得到雜種骨髓瘤細胞。3）雜種細胞既具有B淋巴細胞合成專一抗體的特性，也有骨髓瘤細胞能在體外培養(yǎng)增殖永存的特性，用這種來源于單個融合細胞培養(yǎng)增殖的細胞群，可制備抗一種抗原

30、決定簇的特異單克隆抗體。與多抗相比，單抗純度高，專一性強、重復(fù)性好、且能持續(xù)地?zé)o限量供應(yīng)。5、HAT篩選雜交瘤細胞原理細胞融合時加入HAT（H為次黃嘌呤、A為氨基喋呤、T為胸腺嘧啶）選擇系統(tǒng)，目的是保證只有雜交瘤細胞的生長。HAT培養(yǎng)基是含有由次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)、胸腺嘧啶(T)、的一種選擇性培養(yǎng)基，這三種成分與細胞DNA合成有關(guān)。A可阻斷細胞利用正常途徑合成DNA，細胞在含有氨基碟呤的培養(yǎng)基中不能通過正常途徑合成DNA。這時正常細胞可以通過“補救合成途徑”,由胸腺嘧啶激酶（HK）和次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）利用T和H合成核酸而繁殖。骨髓瘤細胞都是HGPRT缺乏株，不能利用

31、H和T合成DNA，而B細胞中有這種酶，但在體外培養(yǎng)只存活57天，所以只有脾-瘤才能在HAT選擇培養(yǎng)基上生長。6、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）原理ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。 結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。 第六章外植體：用于植物組織（細胞）培養(yǎng)的器官或組織（的切段）。愈傷組織：在人工培養(yǎng)基上，由外植體的表面形成的一團不定形的排列疏松的薄壁細胞。細胞全能性：植物的每個細胞都攜帶一整套遺傳信息，具有發(fā)育成完整植株的潛力。 脫分化：已經(jīng)分化的細胞、組織、器官在人工培養(yǎng)的條件下又變成未分化的細胞和組

32、織的過程。 再分化：通過脫分化誘導(dǎo)形成的愈傷組織在適宜的培養(yǎng)條件下可再分化為胚狀體或直接分化出器官。植物細胞培養(yǎng)：在離體條件下將易分散的植物組織或植物的愈傷組織置于液體培養(yǎng)基中，將組織振蕩分散成游離的懸浮細胞（單個細胞），通過繼代培養(yǎng)使細胞增殖來獲得大量細胞群體的方法。1、植物組織與細胞培養(yǎng)的區(qū)別與聯(lián)系培養(yǎng)對象不同植物組織培養(yǎng)包括植物器官和組織如根、莖、葉、花、果實、種子等。動物細胞培養(yǎng)包括各種單細胞、單倍體細胞、原生質(zhì)體、小細胞團、固定化細胞等。愈傷組織培養(yǎng)既屬于組織培養(yǎng)又屬于細胞培養(yǎng)。培養(yǎng)目的不同 組織培養(yǎng)：獲得植物組織和再生成植株，或利用發(fā)狀根培養(yǎng)生產(chǎn)某些次級代謝物。主要用于植株的產(chǎn)業(yè)化

33、生產(chǎn)和繁育。 細胞培養(yǎng)：獲得細胞和產(chǎn)物，進行生物轉(zhuǎn)化，進行種質(zhì)保存、人工種子的制備和植株的大規(guī)?？焖俜敝?。2、外植體的選擇和預(yù)處理1、外植體的選擇：適當(dāng)生長期的健康植株、細胞之間粘連程度小，如 葉片組織。2、外植體的預(yù)處理：（1）沖刷材料： 流水 ，幾分鐘-數(shù)小時，加洗衣粉、 吐溫等表面清洗劑。 (2) 表面浸潤滅菌：超凈臺，70%酒精，10-30S。（3）深層滅菌：氯化汞、次氯酸鈉等。 （4）無菌水沖洗。 3min/次，3-10次。3、愈傷組織培養(yǎng)的一般程序1.培養(yǎng)基配制2.愈傷組織誘導(dǎo)3.繼代培養(yǎng)4.從愈傷組織分離得到細胞4、一個好的懸浮細胞系有哪些特征？用于建立懸浮細胞系的愈傷組織有何要

34、求？特性：松散性好，增殖快，再生能力強。其外觀一般是鮮艷的乳白或淡黃色，呈細小顆粒狀，松散易碎。要求：選擇適宜的外植體：胚、胚軸、子葉是最常用的外植體，特別是幼胚。選擇適宜的培養(yǎng)基：生長素濃度很重要配合一定濃度的細胞分裂素；添加附加物。愈傷組織要進行繼代選擇：選擇疏松好、細胞狀態(tài)好的細胞不斷繼代培養(yǎng)。5、為什么要進行植物組織固定化培養(yǎng)雖然細胞懸浮培養(yǎng)能夠產(chǎn)生大量次生代謝物，但是人們所期待的次生代謝物往往產(chǎn)量不高，細胞固定后的密集而緩慢的生長有利于細胞的分化和組織化，從而有利于次生代謝物質(zhì)的合成。此外，細胞固定化后不僅便于對環(huán)境因子的參數(shù)進行調(diào)控，而且有利于在細胞團間形成各種化學(xué)物質(zhì)和物理因素的梯度，這可能是調(diào)控高產(chǎn)次生物質(zhì)的關(guān)鍵。與植物懸浮培養(yǎng)比較，固定化植物細胞具有穩(wěn)定性好，產(chǎn)物容易分離、利于連續(xù)花生產(chǎn)等特點。但是只適用可以分泌到細胞外的次級代謝物的生產(chǎn)。6、常見的植物細胞生物反應(yīng)器有有哪些？各有和優(yōu)缺點？1）攪拌式生物反應(yīng)器 優(yōu)點：混合性好，傳氧效率高，操作彈性大，可用于細胞高密度培養(yǎng)等。缺點：由于植物細胞對攪拌是所產(chǎn)生的剪切力的忍耐力較差，傳統(tǒng)的攪拌式生物反應(yīng)器通常易對細胞產(chǎn)生傷害。2）氣升式生物反應(yīng)器 優(yōu)點：剪切力小，結(jié)構(gòu)簡單，好的無菌狀態(tài)。氧的傳遞速率較高。缺點：操作彈性小，低氣速在高密度培養(yǎng)時，其混合效果較差，植物細胞生長較慢。3）鼓泡式生物反應(yīng)器 優(yōu)點：容