中藥化學(xué) 第二單元 分離追蹤有效成分課件

1、藥理活性指導(dǎo)下提取分離追蹤有效成分方法：常采用遞增極性的溶劑法對(duì)中藥材進(jìn)行提取，對(duì)每部分均進(jìn)行活性測(cè)試，確定有效部位。然后在藥理活性指導(dǎo)下進(jìn)一步分離 采用水溶液提取，然后采用遞增極性的溶劑萃取或色譜分離成若干部分進(jìn)行活性測(cè)試，確定有效部位。采用7095%的乙醇回流提取，然后回收乙醇補(bǔ)加水至（1：1）體積再分別采用遞增極性的溶劑萃取分離成幾大部分進(jìn)行活性測(cè)試，確定有效部位。注意事項(xiàng)：1.生物科研設(shè)計(jì)的原則：對(duì)照、重復(fù)和隨機(jī)。 2.正確選擇活性測(cè)試方法3.確保供試材料具有活性 4.中藥的多方面的活性5.在分離過(guò)程中要注意量效關(guān)系.6.藥理實(shí)驗(yàn)與臨床療效不平行的問(wèn)題 正確選擇活性測(cè)試方法活性測(cè)試方法

2、選擇的正確與否是活性追蹤分離能否取得成功的關(guān)鍵。常用的活性測(cè)試方法有:整體動(dòng)物、動(dòng)物的器官、組織、細(xì)胞、酶、受體以及藥物對(duì)體內(nèi)某些生物活性物質(zhì)的抑制或促進(jìn)等。 無(wú)疑采用整體動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)與人比較相近，但所需實(shí)驗(yàn)費(fèi)用很大、現(xiàn)象復(fù)雜、時(shí)間長(zhǎng)加以動(dòng)物個(gè)體差異以及病理模型難于建立等因素，實(shí)際上用其指導(dǎo)活性追蹤分離難于做到。一般最好的方法是: 尋找活性部位時(shí)-用整體動(dòng)物試驗(yàn) 追蹤分離成分 -選用體外的方法 理想的體外活性測(cè)試方法應(yīng)具有簡(jiǎn)易、快速、不需特殊設(shè)備、方便、抗干擾性強(qiáng)、假陽(yáng)性和假陰性均較低、臨床相關(guān)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但在實(shí)際工作中理想的活性測(cè)試方法往往很難找到，只有綜合分析考慮，根據(jù)實(shí)際情況、條件以及研

3、究開(kāi)發(fā)的課題選擇較理想的活性測(cè)試方法。同時(shí)也要根據(jù)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)積累和科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，改進(jìn)現(xiàn)有的一些活性測(cè)試方法和建立一些新的活性測(cè)試方法。中藥有效成份的活性評(píng)價(jià)技術(shù)進(jìn)展簡(jiǎn)介高通量藥物篩選 (High throughput screening,HTS)技術(shù)生物芯片(biological chip or biochip)技術(shù)親和層析(affinity chromatography)技術(shù)血清藥理學(xué)(Plasma pharmacology) 高通量藥物篩選(High throughput screening,HTS) 此技術(shù)是20世紀(jì)80年代后期發(fā)展起來(lái)的一種尋找新藥物的高新技術(shù),它是將多種技術(shù)方法有機(jī)結(jié)

4、合而形成的新技術(shù)體系,是以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ),以微板形式作為實(shí)驗(yàn)工具載體,以自動(dòng)化操作系統(tǒng)執(zhí)行試驗(yàn)過(guò)程,以靈敏快速的檢測(cè)儀器采集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),以計(jì)算機(jī)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理,可在同一時(shí)間對(duì)數(shù)以千、萬(wàn)計(jì)的樣本進(jìn)行檢測(cè),并以相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)支持整個(gè)技術(shù)體系的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。生物芯片(biological chip or biochip) 自從1991年美國(guó)stephen fodor等提出DNA芯片概念,隨著人類基因組計(jì)劃(HumanGenome Project,HGP)的實(shí)施,生物芯片技術(shù)已成為基因組計(jì)劃中的一種重要技術(shù)手段。此技術(shù)采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法,將大量生物大分子如核酸片段、多肽分

5、子、甚至組織切片、細(xì)胞等生物樣品,有序固化于玻片、硅片、尼龍膜等載體作為支持物的表面,組成密集二維分子排列,與已標(biāo)記的待測(cè)生物樣品中的靶分子雜交,通過(guò)特定檢測(cè)器對(duì)雜交后芯片上標(biāo)記信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效檢測(cè)分析,從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。生物芯片把生化分析系統(tǒng)中的樣品制備、生化反應(yīng)和結(jié)果檢測(cè)三個(gè)部分有機(jī)地結(jié)合起來(lái)連續(xù)完成。 依據(jù)芯片探針的不同,生物芯片可分為: 1.基因芯片 2.蛋白質(zhì)芯片 3.芯片實(shí)驗(yàn)室。應(yīng)用： 目前,在中藥研究中應(yīng)用最多的是基因芯片和蛋白質(zhì)芯片。 利用基因芯片技術(shù)可以了解正常組織與疾病組織基因表達(dá)譜的差異,基因表達(dá)的增加或減少可能就是病生理的原因或結(jié)果,引起疾病的多

6、個(gè)基因產(chǎn)物可作為藥物作用的靶分子,通過(guò)使表達(dá)異常的基因恢復(fù)正常表達(dá)或使異常減輕可以指導(dǎo)藥物篩選; 通過(guò)分析用藥前后機(jī)體的不同組織、器官基因表達(dá)譜的變化,可找出靶基因及受到靶基因調(diào)控的基因,并能研究是否影響其他基因的表達(dá)而帶的毒副作用。 蛋白質(zhì)芯片是利用肽或蛋白質(zhì)能特異性與配體分子(如抗原和抗體)結(jié)合的原理制備而成,它可以將肽或蛋白質(zhì)固定到膜上制成肽芯片,與樣品發(fā)生反應(yīng)后加入標(biāo)記分子,然后用閱讀儀來(lái)分析結(jié)果。蛋白質(zhì)芯片可用于多肽類藥物的篩選。 我國(guó)開(kāi)展生物芯片研究時(shí)間不長(zhǎng),但已有眾多大學(xué)開(kāi)展生物芯片研制,如:清華大學(xué)、北京大學(xué)、第一軍醫(yī)大學(xué)等;也誕生了多家生物芯片公司,如:上海博華、北京奧博及北

7、京國(guó)家生物芯片研究中心等。如北京國(guó)家生物芯片研究中心采用自行研制的酵母全基因組DNA芯片,與北京大學(xué)藥學(xué)院合作研究多種抗真菌中藥。 世界上一些大型制藥公司將生物芯片技術(shù)用于基因多態(tài)性、疾病相關(guān)性、藥物篩選.親和層析(affinity chromatograph) 親和層析,又稱生物選擇性吸附層析,是以目標(biāo)生物分子與其它分子的特異和可逆的結(jié)合能力為基礎(chǔ),將具有特殊結(jié)構(gòu)的親和分子制成固相吸附劑放置在層析柱中,當(dāng)要被分離的生物分子混合液通過(guò)層析柱時(shí),與吸附劑具有親和能力的生物分子就會(huì)被吸附而滯留在層析柱中。那些沒(méi)有親和力的生物分子由于不被吸附,直接流出,從而與被分離的生物分子分開(kāi),然后選用適當(dāng)?shù)南疵?/p>

8、液,改變結(jié)合條件將被結(jié)合的生物分子洗脫下來(lái)。親和層析是至今最有效的生物活性物質(zhì)純化技術(shù)。對(duì)于自然界成本相對(duì)較低,如人血液、尿、動(dòng)物器官、蛇毒等,采集成本相對(duì)較低,可直接進(jìn)行高效分離純化。應(yīng)用： 正因親合層析的選擇性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、分離時(shí)間短而效率高,且一般不損壞生物高分子的生物活性,所以,受到人們的普遍青睞,尤其適用于蛋白質(zhì),如酶、抗原、抗體、肽類激素、受體及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等的分離純化。 目前,國(guó)內(nèi)開(kāi)發(fā)的蚓激酶口服液溶栓藥物含有大量的雜蛋白,影響藥效的發(fā)揮。利用親和層析技術(shù)一步提取出全部溶栓成份,質(zhì)量和收率在國(guó)內(nèi)領(lǐng)先。陳登鴻等研究了單克隆抗體親和層析一步純化重組人生長(zhǎng)激素。又如我國(guó)首次從銀紋夜蛾幼蟲(chóng)血

9、淋巴中采用親和層析法獲得純度高達(dá)98%的具生物活性的rhlL-12,從而使該研究達(dá)到國(guó)際領(lǐng)先水平。我國(guó)從1991年開(kāi)始對(duì)親和配基進(jìn)行研究,目前 已有數(shù)百種親和介質(zhì)和數(shù)萬(wàn)種親和配基可供選用和優(yōu)化,研究和技術(shù)水平與世界同步。血清藥理學(xué)(Plasma Pharmacology) 1984年日本學(xué)者Hiroko Iwama首次提出此概念;1988年日本學(xué)者田代真一正式提出“血清藥理學(xué)”的概念。 血清藥理學(xué)是指給動(dòng)物灌服中藥,在一定時(shí)間里,取其血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn),它是一種新的藥理學(xué)尤其是中藥藥理學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法。應(yīng)用: 中藥血清藥理學(xué)在1990年以后才開(kāi)始在我國(guó)受到重視,目前,中藥血清藥理學(xué)的應(yīng)用處于探討階段。盡

10、管中藥血清藥理學(xué)的應(yīng)用尚存許多問(wèn)題,但在復(fù)方藥理學(xué)研究中具有不可替代的作用。 目前,中藥血清藥理學(xué)方法的應(yīng)用領(lǐng)域主要在抗自由基、抗腫瘤、抗病毒、抗菌實(shí)驗(yàn)等體外實(shí)驗(yàn)上;此外,中藥血清藥理學(xué)在中藥的藥效學(xué)、藥動(dòng)學(xué)、藥劑學(xué)及藥理學(xué)方面有廣闊的應(yīng)用前景,必將在中藥的現(xiàn)代化研究中發(fā)揮積極的作用。確保供試材料具有活性確保供試材料具有活性是能夠追蹤到活性化合物的前提。在活性追蹤分離之前一定要采用體內(nèi)、體外多種方法，多個(gè)指標(biāo)對(duì)實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行活性測(cè)試，其目的第一是再次確證實(shí)驗(yàn)材料的活性，確定有無(wú)進(jìn)一步研究的價(jià)值；二是為選擇活性追蹤分離所用的活性測(cè)試方法提供依據(jù)。上面的流程是美國(guó)癌癥研究中心(NCl)用于篩選確認(rèn)植

11、物或動(dòng)物粗提物抗腫瘤活性的改進(jìn)力案，可供工作時(shí)參考。通過(guò)該方案確認(rèn)的實(shí)驗(yàn)材料至少有以下三個(gè)優(yōu)點(diǎn)： 不至于丟失活性低或含量少的化合物 增加了分離出新化合物的機(jī)會(huì)； 有可能分離到具有不同作用機(jī)理或新的 作用機(jī)理的化合物。中藥的多方面的活性中藥在臨床上往往具有多方面的治療作用，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上具有多方面的活性，在體外實(shí)驗(yàn)中具有多個(gè)作用靶點(diǎn)。多組分、多靶位、多因素、多環(huán)節(jié)研究者應(yīng)當(dāng)從這些雜亂的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象中找出其中最本質(zhì)的作用，選擇建立能反映臨床治療特點(diǎn)且效果與之平行的活性測(cè)試體系才有可能追蹤分離出有開(kāi)發(fā)價(jià)值的活性成分及先導(dǎo)化合物。在分離過(guò)程中要注意量效關(guān)系在分離過(guò)程中要按“等劑量不等強(qiáng)度原則”對(duì)每一階段所得

12、組分進(jìn)行活性定量評(píng)估并與母體進(jìn)行比較，追蹤分離活性最強(qiáng)的餾分。通常： 1如與母體比較所得幾個(gè)組分活性強(qiáng)弱參差不齊，則說(shuō)明活性分離與物質(zhì)分離平行，預(yù)示可能獲得良好的分離效果； 2如果某個(gè)組分活性顯著增強(qiáng)，則說(shuō)明在分離過(guò)程中可能除去了某種具有拮抗作用的物質(zhì)； 3如果所得各組分活性均明顯減弱，即使將其合并，其活性與母體相比也大大減弱，則提示活性成分可能發(fā)生分解、破壞或產(chǎn)生了不可逆吸附； 4如果所得各組分分別測(cè)試其活性雖然明顯降低，但將其合并后其活性與母體相當(dāng)則提示是活性成分被分散或該藥中的成分存在明顯的協(xié)同作用(相加或相乘)，故分離后導(dǎo)致活性的減弱或消失。藥理實(shí)驗(yàn)與臨床療效不平行的問(wèn)題 由于一個(gè)藥物

13、療效的發(fā)揮并不只取決于它與藥物靶點(diǎn)的作用強(qiáng)弱，還與它的吸收、分布、代謝、排泄、到達(dá)靶點(diǎn)的濃度及持續(xù)時(shí)間、體內(nèi)對(duì)外影響的綜合平衡能力等有關(guān)因素，所以體外活性測(cè)試方法所得結(jié)果與藥物在體內(nèi)實(shí)際作用并不平行。即使是動(dòng)物整體實(shí)驗(yàn)，由于種族的差異以及病理模型與臨床上的實(shí)際病癥并不完全一樣，所以也存在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床療效不平行的問(wèn)題故在實(shí)踐工作中應(yīng)予以注意。中藥化學(xué)成分研究的預(yù)試驗(yàn)在提取分離某種中藥成分之前或者經(jīng)中藥藥理篩選找出有效部位之后，一般進(jìn)行簡(jiǎn)單的預(yù)試驗(yàn)，初步了解其中可能含有哪些類型的成分，以便根據(jù)這些化合物的類型和性質(zhì)作定向提取分離或者尋找指示提取分離的顯色劑和定性試劑。常用的方法有試管法，紙片斑點(diǎn)

14、法圓形濾紙徑向?qū)游龇ㄈN。圓形濾紙徑向?qū)游龇ú僮鞣椒? 1.預(yù)試樣品溶液的制備 2.點(diǎn)樣 3.展開(kāi) 4.顯色 1.預(yù)試樣品溶液的制備 較常采用的為遞增極性的溶劑法，就是根據(jù)中草藥成分親脂性強(qiáng)弱的程度，選擇各種極性不同的溶劑，依次進(jìn)行提取，使分為若干部分。例如常將中草藥原料依次用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、水等溶劑進(jìn)行提取.1.預(yù)試樣品溶液的制備 (1)水浸液： 取中藥粉末4g加40m1蒸餾水浸泡過(guò)夜，濾取3ml濾液供檢查氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)，其余部分在60水浴中加熱約10分鐘，取濾液供糖類、有機(jī)酸、皂甙、酚甙類、鞣質(zhì)及水溶性生物堿的撿查。(2)中性醇提取液： 取中藥粉末5g，加60m

15、1 95%乙醇在水浴中加熱回梳20分鐘,濾過(guò),濾液供黃酮、蒽醌、香豆素、萜類、甾體和揮發(fā)油類的檢查。(3)酸性醇提取液： 取中藥粉末2g，加含05%鹽酸的乙醇液10mI，水浴上回流10分鐘，濾過(guò)，濾液供生物堿檢查用。2.點(diǎn)樣 取直徑約13cm的整潔圓形層析濾紙一張，中心打一直徑約45mm的小孔，用鉛筆將濾紙劃分為若干等分(6，8或10等分均可)并在距中心孔lcm處用阿拉伯?dāng)?shù)字或x標(biāo)記原點(diǎn)位置；(點(diǎn)樣時(shí)可點(diǎn)成弧狀；也可點(diǎn)成圓點(diǎn))然后用毛細(xì)管(或微量注射器)，在原點(diǎn)分別點(diǎn)上前述的三種樣品溶液(可重復(fù)點(diǎn)樣23次)展開(kāi) 點(diǎn)樣后在濾紙中心孔插入濾紙芯,移到盛有展開(kāi)劑的培養(yǎng)皿(直徑12cm)上，上扣一個(gè)同

16、樣大小的培養(yǎng)皿。待溶劑前沿到達(dá)濾紙邊緣時(shí)，取下濾紙立即標(biāo)記溶劑前沿位置通用展開(kāi)劑: 可選用正丁醇-醋酸-水(4：1：5) 或95%乙醇。專用展開(kāi)劑有： (1)生物堿常選用氯仿甲醇(96:4)。 (2)黃酮類化合物常選用15%醋酸。 (3)皂甙、強(qiáng)心甙、氨基酸多選用正丁醇醋酸水(4： 1:1)。 (4)極性小的其它成分可選用苯無(wú)水乙醇(8：2)。顯色 溶劑揮干后沿鉛筆劃分的等分線剪開(kāi)，分別用后述的顯色劑噴霧顯色，干后或加熱后觀察有無(wú)色斑,并按下式計(jì)算比移植(Rf值)。根據(jù)斑點(diǎn)的顏點(diǎn)及Rf值可作為化合物的初步定性鑒別。注： 1.若作單項(xiàng)預(yù)試可按圖線剪開(kāi)后噴霧一種或一類顯色劑即可. 2.若作系統(tǒng)預(yù)試

17、可按上述方法多作幾張圓形層析圖后按鉛筆劃分的等分線剪開(kāi)，分別噴上各種顯色劑。顯色劑與結(jié)果判斷: 1。檢查生物堿，用碘化鉍鉀試劑顯色，如呈棕紅色斑點(diǎn)為正反應(yīng)。 2檢查酚性成分。用2%FeCl3乙醇液與2%鐵氰化鉀水溶液，臨用時(shí)等量混合噴霧顯色，如呈藍(lán)色斑點(diǎn)為正反應(yīng)。 3檢查有機(jī)酸可用01%溴酚蘭試劑如在藍(lán)色背景上顯黃色斑點(diǎn)為正反應(yīng) 4。檢查植物甾醇；甾體皂甙、三萜皂甙可用： (1) 用新配制的5%磷鉬酸乙醇液噴灑，并于120烘至顯色，如顯藍(lán)色藍(lán)紫色斑點(diǎn)為正反應(yīng)。 (2)用1%硫酸鋅試劑或10%硫酸試劑噴灑,并于95110加熱2、5分鐘，因結(jié)構(gòu)不同顏色各異，呈淡紅色、棕紅色，紫紅色、綠色或藍(lán)色等(限薄層板使用)。5檢查內(nèi)酯: 香豆精類可用異羥肟酸鐵噴灑，如呈藍(lán)色、紫色斑點(diǎn)為正反應(yīng)。6檢查黃酮類成分: