基因組測序和序列組裝

1、關(guān)于基因組測序與序列組裝第1頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四什么是基因組什么是基因DNA測序的方法DNA序列的組裝主要內(nèi)容:第2頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四1. 什么是基因組 基因組就是一個物種中所有基因的整體組成。 基因組有兩層意義：遺傳物質(zhì)和遺傳信息。 要揭開生命的奧秘，就需要從整體水平研究基因的存在、基因的結(jié)構(gòu)與功能、基因之間的相互關(guān)系。 第3頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四第4頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四Zea mays 8,000Homo sapiens 3,000Oryza sativa

2、 400Drosophila melanogaster 165Arabidopsis thaliana 100Saccharomyces cerevisiae 12E.coli 4.6Genome Size (Mb)第5頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四什么是C 值？通常是指一種生物單倍體基因組DNA的總量. 在真核生物中，C值一般隨著生物的進化而增加，高等生物C值一般大于低等生物。 C值悖理： 生物的復(fù)雜性與基因組的大小并不完全成比例增加第6頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四細菌真菌等動物陰影部分為一個門內(nèi)C-值的范圍第7頁，共46頁，2022年，5月

3、20日，6點3分，星期四重復(fù)順序高度重復(fù)順序： 長度：幾個幾千個bp 拷貝數(shù)：幾百個上百萬個 首尾相連，串聯(lián)排列 集中分布于染色體的特定區(qū)段（如端粒，著絲粒等） 也稱衛(wèi)星DNA中度重復(fù)順序： 一般分散于整個基因組中； 長度和拷貝數(shù)差別很大單一順序： 基因主要位于單一順序 動物中單一順序約占50 植物中單一順序約占20第8頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四 DNA 的復(fù)性 遵循二級反應(yīng)動力學(xué)，可表述為：dCt / dt = -KC02 反應(yīng)達 t 時，單鏈DNA濃度 = CtC0 = 單鏈 DNA起始濃度 K 復(fù)性速度常數(shù)順序復(fù)雜性第9頁，共46頁，2022年，5月20日，6

4、點3分，星期四Cot(1/2) = 1/K (mol. Sec / L) 常數(shù) Ct/C0 0101C0t(1/2) C0t(1/2) C0t(1/2)值與基因組復(fù)雜性成正比。第10頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四 是遺傳信息的物理和功能單位，包含產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。 基因分類： 編碼RNA的基因，如rRNA基因，snRNA基因等； 編碼蛋白質(zhì)的基因2. 什么是基因？第11頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四基因的不連續(xù)性Intron 和Exon: 大多數(shù)真核生物蛋白質(zhì)基因的編碼順序(Exon)都被或長或短的非編碼順序(In

5、tron)隔開第12頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四基因家族 一群具有一致的或相似順序的基因,有的還擔(dān)負類似的生物學(xué)功能, 可以相互補償, 比如:E2f transcription factor Mouse symbolHuman OrthologE2f1E2F1 E2f2E2F2E2f3E2F3E2f4E2F4E2f5E2F5E2f6E2F6第13頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四假基因(Pseudogene) 來源于功能基因但已失去活性的DNA序列產(chǎn)生假基因的原因有:由重復(fù)產(chǎn)生的假基因;加工的假基因, 由RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后再整合到基因組中;

6、殘缺的基因(Truncated gene) 第14頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四假基因的產(chǎn)生途徑之一第15頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四重疊基因:同一段DNA 能攜帶兩種不同蛋白的信息.重迭基因有以下幾種情況：*一個基因完全在另一個基因內(nèi)部*部分重疊* 兩個基因共用少數(shù)堿基對 第16頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四*一個基因完全在另一個基因內(nèi)部如：B和A， E和D 其讀碼結(jié)構(gòu)互不相同 -ATG-/-AATGCC -/-ATAACG-/-TAA-A*BATGCCN-NNATAA第17頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3

7、分，星期四*部分重疊 如： K和C *兩個基因共用少數(shù)堿基對 如： D和J-TAATG-D 終止密碼子J 起始密碼子第18頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四3. DNA測序的方法鏈終止法測序化學(xué)降解法測序自動化測序非常規(guī)DNA測序第19頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四3.1 鏈終止法測序(the chain termination method) 基本原理: 通過合成與單鏈DNA互補的多核苷酸鏈，由于合成的互補鏈可在不同位置隨機終止反應(yīng)，產(chǎn)生只差一個核苷酸的DNA分子，從而來讀取待測DNA分子的順序。第20頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分

8、，星期四技術(shù)路線與要求制備單鏈模板 將單鏈模板與一小段引物退火 加入DNA多聚酶 4種脫氧核苷酸分別加入少量4種雙脫氧核苷酸 將4種反應(yīng)產(chǎn)物分別在4條泳道電泳 根據(jù)4個堿基在4條泳道的終止位置讀出基因序列 A 克隆于質(zhì)粒中DNA用堿或熱變性B M13克隆單鏈DNAC 噬?？寺NAD PCR產(chǎn)生單鏈DNAA 高酶活性B 無53外切酶活性C 無35外切酶活性ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP 的3碳原子連接的是氫原子,不是羥基第21頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四第22頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四第23頁，共46頁，2022年，5月20

9、日，6點3分，星期四3.2 化學(xué)降解法測序基本原理: 在選定的核苷酸堿基中引入化學(xué)集團,再用化合物處理,使DNA分子在被修飾的位置降解.第24頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四技術(shù)路線 將雙鏈DNA樣品變?yōu)閱捂?每個單鏈的同一方向末端都用放射性同位素標(biāo)記,以便顯示DNA條帶 分別用不同方法處理,獲得只差一個核苷酸的降解DNA群體 電泳,讀取DNA的核苷酸順序第25頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四Maxam-Gilbert 法所用的化學(xué)技術(shù)堿基特異修飾方法GpH8.0,用硫酸二甲酯對 N7進行甲基化,使 C8-C9鍵對堿基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0

10、 哌啶甲酸可使嘌呤環(huán)的N原子化,從而導(dǎo)致脫嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鳥嘌呤的糖苷鍵C+T肼可打開嘧啶環(huán),后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易除去C1.5mol/L NaCl存在時,可用肼除去胞嘧啶第26頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四化學(xué)法測序?qū)嵗哙さ?7頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四3.3 自動化測序基本原理 與鏈終止法測序原理相同,只是用不同的熒光色彩標(biāo)記ddNTP,如ddATP標(biāo)記紅色熒光,ddCTP標(biāo)記藍色熒光, ddGTP標(biāo)記黃色熒光, ddTTP標(biāo)記綠色熒光.由于每種ddNTP帶有各自特定的熒光顏色,而簡化為由1個泳道同時判讀4種堿基.第28頁，共

11、46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四第29頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四3.4 非常規(guī)測序 毛細管電泳 用毛細管電泳取代聚丙烯凝膠平板電泳,節(jié)省時間,加快測序進程,其他程序同鏈終止法或化學(xué)測序法. 光點測序 脫氧三磷酸核苷酸連接到DNA 3-末端時會釋放1個焦磷酸(PPi) ,焦磷酸在磷酸化酶的作用下轉(zhuǎn)化為化學(xué)能,并發(fā)出光亮.由此,往反應(yīng)液中每次只加入1種核苷酸,當(dāng)加入的核苷酸結(jié)合時,反應(yīng)液發(fā)出亮點,并記錄核苷酸種類;當(dāng)核苷酸未結(jié)合時,反應(yīng)液中的核苷酸酶迅速分解此核苷酸,由此來測定DNA序列.第30頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四毛細管

12、電泳儀第31頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四DNA芯片測序 基本原理 將各種排列順序的寡核苷酸點播在芯片上, 每個點播的寡核苷酸在排列的方陣中都有指定的位置.待檢測的DNA分子與芯片溫浴,凡是能雜交的寡核苷酸都會在確定位置發(fā)出信號,然后根據(jù)獲取的信息將寡核苷酸的順序進行對比組裝,拼接成完全的DNA順序.第32頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四利用基因芯片進行雜交測序的原理第33頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四4 序列的組裝4.1 隨機測序與序列組裝 隨機測序也稱”鳥槍法”. 序列組裝原理:直接從已測序的小片段中尋找彼此重疊的測序克

13、隆,然后依次向兩側(cè)鄰接的序列延伸. 優(yōu)點:不需預(yù)先了解任何基因組的情況.ABCABCABCABC小片段測序計算機拼裝第34頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四ABC小片段測序計算機拼裝鳥槍法(Shotgun)測序的問題 CAATGCATTAGCAGCCAATGCGAP錯裝第35頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四實例:流感嗜血桿菌基因組的測序及順序組裝超聲波打斷純化的基因組DNA 瓊脂糖電泳收集1.62.0Kb的區(qū)段、純化 構(gòu)建到質(zhì)粒載體中 隨機挑選19687個克隆,進行28643次測序,得到可讀順序為11 631 485 bp 組裝成140個覆蓋全基因組范

14、圍的獨立的順序重疊群, 第36頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四 各重疊群間仍有間隙 順序間隙 物理間隙載體或宿主菌 選用不當(dāng)而被丟失的順序測序時遺漏的測序解決辦法:通過相鄰已知順序作為探針篩選已有的基因組文庫解決辦法:利用其它宿主菌與載體重新構(gòu)建文庫第37頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四4.2 限制測序 限制測序：是指將一段染色體區(qū)段的DNA 順序進行組裝. 一些已繪制了遺傳圖與物理圖的微生物基因組測序中也采用這一方法. 如高等植物擬南芥基因組的測序完全依據(jù)克隆重疊群,先進行各個BAC克隆的隨機測序,再進行序列組裝； 水稻基因組測序計劃采取得策略與此

15、相同.第38頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四4.3 指導(dǎo)測序與序列組裝 建立在基因組圖譜基礎(chǔ)上的”鳥槍法”,即所謂”指導(dǎo)鳥槍法”或”指導(dǎo)測序”。 在人類基因組進入測序組裝階段就采用此方法，其基本步驟如下: A 構(gòu)建平均為2Kb的人類基因組質(zhì)粒文庫,進行雙向測序; B 構(gòu)建平均10Kb的人類基因組質(zhì)粒文庫,進行雙向測序,讀取2個端部順序; C 參考人類基因組圖,特別是大量的STS位標(biāo)作為基點,進行序列組裝，排成重疊克隆群.第39頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四 先將染色體打成比較大的片段(幾十幾百Kb), 利用分子標(biāo)記將這些大片段排成重疊的克隆群(Co

16、ntig), 分別測序后拼裝. 這種策略叫基于克隆群(contig-based)的策略.ABCABC大片段contig小片段測序拼裝第40頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四兩種策略的比較鳥槍法策略 指導(dǎo)測序策略不需背景信息 構(gòu)建克隆群 (遺傳、物理圖譜)時間短 需要幾年的時間 需要大型計算機得到的是草圖(Draft) 得到精細圖譜第41頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四4.5 其他測序路線重要區(qū)域優(yōu)先測序 人們對感興趣的基因或與疾病相關(guān)的基因優(yōu)先測序.如:人類主要組織相容性復(fù)合區(qū)位于第6號染色體,與人類免疫系統(tǒng)有關(guān)，因而優(yōu)先測序.第42頁，共46頁，2022年，5月20日，6點3分，星期四EST (Expressed sequence tag) 測序 EST是一種重要的基因組圖分子標(biāo)記,以EST為探針很容易從 cDNA文庫中篩選全基因,又可從BAC克隆中找到其基因組的基因序列. 優(yōu)點: A mRNA 可直接反轉(zhuǎn)錄成cDNA,而且cDNA文庫也比較容易構(gòu)建; B 對cDNA文庫大量測序,即可獲得大量E