基因敲除小鼠構(gòu)建

1、關(guān)于基因敲除小鼠的構(gòu)建第1頁，共15頁，2022年，5月20日，5點58分，星期四1.基因敲除簡介2.基因敲除方法及其原理 2.1基因敲除小鼠的構(gòu)建 2.2其他基因敲除方法3.基因敲除應(yīng)用第2頁，共15頁，2022年，5月20日，5點58分，星期四1.基因敲除簡介基因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理，用設(shè)計的同源片段替代靶基因片段，從而達到基因敲除的目的。第3頁，共15頁，2022年，5月20日，5點58分，星期四2.基因敲除方法及其原理同源重組法插入突變法RNAi法第4頁，共15頁，2022年，5月20日，5點58分，星期四2.1基因敲除小鼠的構(gòu)建利用同源重組構(gòu)建基因敲除小鼠的基本步驟 7第

2、5頁，共15頁，2022年，5月20日，5點58分，星期四1）基因載體的構(gòu)建 把目的基因和與細(xì)胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA 分子都重組到帶有標(biāo)記基因的載體上，成為重組載體。第6頁，共15頁，2022年，5月20日，5點58分，星期四2）ES 細(xì)胞的獲得： 現(xiàn)在基因敲除一般采用是胚胎干細(xì)胞，最常用的是鼠，而兔，豬，雞等的胚胎干細(xì)胞也有使用。第7頁，共15頁，2022年，5月20日，5點58分，星期四3）同源重組： 將重組載體通過一定的方式導(dǎo)入同源的胚胎干細(xì)胞(ES cell)中，使外源DNA與胚胎干細(xì)胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中，從而得以表達第8頁

3、，共15頁，2022年，5月20日，5點58分，星期四4）選擇篩選已擊中的細(xì)胞： 目前常用的方法是正負(fù)篩選法（PNS法），標(biāo)記基因的特異位點表達法以及PCR法。其中應(yīng)用最多的是PNS法。5）表型研究： 通過觀察嵌和體小鼠的生物學(xué)形狀的變化進而了解目的基因變化前后對小鼠的生物學(xué)形狀的改變，達到研究目的基因的目的。第9頁，共15頁，2022年，5月20日，5點58分，星期四6）得到純合體： 由于同源重組常常發(fā)生在一對染色體上中一條染色體中,所以如果要得到穩(wěn)定遺傳的純合體基因敲除模型，需要進行至少兩代遺傳。第10頁，共15頁，2022年，5月20日，5點58分，星期四該方法通過同源重組將外源基因定點

4、整合入靶細(xì)胞基因組上某一確定的位點，以達到定點修飾改造染色體上某一基因的目的，克服了隨機整合的盲目性和偶然性，是一種理想的修飾、改造生物遺傳物質(zhì)的方法。直到現(xiàn)在，運用基因同源重組進行基因敲除是構(gòu)建基因敲除動物模型中最普遍的使用方法。第11頁，共15頁，2022年，5月20日，5點58分，星期四2.2其他基因敲除方法2.2.1利用隨機插入突變進行基因敲除 此法利用某些能隨機插入基因序列的病毒，細(xì)菌或其他基因載體，在目標(biāo)細(xì)胞基因組中進行隨機插入突變，建立一個攜帶隨機插入突變的細(xì)胞庫，然后通過相應(yīng)的標(biāo)記進行篩選獲得相應(yīng)的基因敲除細(xì)胞。 基因捕獲法是最近發(fā)展起來的利用隨機插入突變進行基因敲除的新型方法

5、 。技術(shù)原理：第12頁，共15頁，2022年，5月20日，5點58分，星期四2.2.2 RNAi引起的基因敲除RNAi基因敲除的優(yōu)點及應(yīng)用 比用同源重組法更加簡便，周期大大縮短。 對于哺乳動物，如對于一些敲除后小鼠在胚胎時就會死亡的基 因，可以在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中利用RNAi技術(shù)研究它的功能。 RNAi還被用來研究在發(fā)育過程中起作用的基因，如可用RNAi來阻斷某些基因的表達，來研究他們是否在胚胎干細(xì)胞的增殖和分化過程中其起著關(guān)鍵作用。 第13頁，共15頁，2022年，5月20日，5點58分，星期四3.基因敲除技術(shù)的應(yīng)用建立生物模型提供廉價的異種移植器官 疾病的分子機理研究和疾病的基因治療 免疫學(xué)中的應(yīng)用 改造生物、培育新的生物品