基因表達(dá)調(diào)控 第三課 mRNA水平的研究9-29課件

1、 mRNA分析技術(shù)基因mRNA蛋白質(zhì)多肽鏈基因表達(dá)基因表達(dá)的變化可以?xún)蓚€(gè)水平進(jìn)行分析：mRNA 水平 和蛋白質(zhì)水平mRNA表達(dá)變化的檢測(cè)方法：Northern blot, RT-PCR(半定量PCR), Real-time PCR (定量PCR), 熒光原位雜交等、基因芯片、高通量測(cè)序等mRNA 表達(dá)變化的機(jī)制的研究方法方法有：?jiǎn)?dòng)子活性分析（轉(zhuǎn)錄水平分析）、mRNA轉(zhuǎn)錄效率分析（Nuclear run on）、mRNA穩(wěn)定性檢測(cè)（轉(zhuǎn)錄后水平）一、RNA研究策略和方法RT-PCR, Real-time PCR，Northern blot, RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn), 差異篩選，基因芯片Total RN

2、A：rRNA約占80-85，tRNA和核內(nèi)小分子RNA約占10%-15%，mRNA約占1%-5%，瓊脂糖凝膠電泳中只能看到：28S，18S，5S。RNA提取注意事項(xiàng)：要注意RNase的污染，因RNA極易被RNase的降解，操作時(shí)應(yīng)盡量少說(shuō)話，并在潔凈的環(huán)境中操作，主要防止手、唾液和空氣中RNase的污染；另一方面使用的所有玻璃儀器、移液器、吸頭和離心管都用0.5%DEPC溶液處理過(guò)夜,然后高壓滅菌15分鐘.但對(duì)于滅菌的一次性使用的塑料制品基本上無(wú)RNase，可以不經(jīng)處理直接用于提取RNA，實(shí)驗(yàn)室用的普通玻璃器皿和塑料制品經(jīng)常有RNase污染，使用前必須180度干烤8小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間（玻璃器皿）或

3、用氯仿沖洗（塑料制品）提取用試劑：Trizol reagent（一）RNA的提?。ǘ㏑T-PCR（半定量PCR）RT-PCR相關(guān)試劑反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄引物1防止RNA的降解，保持RNA的完整性。2. 避免gDNA的污染，用DNase處理。3為了防止非特異性擴(kuò)增，必須設(shè)陰性對(duì)照。4內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參 有GAPDH、-Actin等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。5. 稀釋cDNA，內(nèi)參循環(huán)數(shù)20-26。6. 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度300-500 bp。注意事項(xiàng)：引物設(shè)計(jì)原則在NCBI找到目的基因序列，以

4、CDS區(qū)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。1.最好位于編碼區(qū)5端的300-400bp區(qū)域內(nèi)，可以用DNAman, Alignment 軟件看看結(jié)果。2.引物長(zhǎng)度一般在17-25堿基之間,上下游引物不能相差太大。3.G+C含量在40%-60%之間，45-55最佳。4.引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。5.引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。6.引物5端可以修飾。DNA 或RNA 的絕對(duì)定量分析，包括病原微生物或病毒含量的檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測(cè)，RNAi 基因失活率的檢測(cè)等?；虮磉_(dá)差異分析，例如比較 經(jīng)過(guò)不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異 ( 如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等 ) ，特定基因在不同時(shí)相的

5、表達(dá)差異以及cDNA 芯片或差顯結(jié)果的確證?；蚍中停鏢NP檢測(cè)，甲基化檢測(cè)等。Real-time PCR的應(yīng)用：BAReal-time PCRRT PCR定量PCR引物設(shè)計(jì)軟件：Primer bank將待檢的RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同Southernblot相同的原理進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和用探針進(jìn)行雜交檢測(cè)。Northern blot主要用于檢測(cè)樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）及其含量。（四）Northern blotNorthern blot 流程圖優(yōu)點(diǎn)：northern blot的靈敏度要好于基因芯片實(shí)驗(yàn)，而基因芯片優(yōu)勢(shì)在于 它可在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)反映出幾千個(gè)基因表達(dá)量的變化

6、； 與定量PCR的高靈敏度相比，northern blot較高的特異性可以有效 的減少實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性。缺點(diǎn)： Northern blot 實(shí)驗(yàn)中要防止RNA的降解，所有實(shí)驗(yàn)用品都需要經(jīng) 過(guò)除去RNA酶的過(guò)程，如高溫烘烤、DEPC處理等。同時(shí)， northern blot中很多實(shí)驗(yàn)用品如甲醛、EB、DEPC、紫外燈等對(duì)人 體都有一定的傷害。Northern blot 的優(yōu)勢(shì)在于它可檢測(cè)目的片段的大小、是否具有可變剪切出現(xiàn)、可允許探針的部分不配對(duì)性，雜交過(guò)后的膜經(jīng)過(guò)一定的處理除去探針后還可保存很長(zhǎng)時(shí)間再次雜交使用。（五）核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)（ribonuclease protection assa

7、y，RPA）是靈敏度和特異性很高的mRNA定量分析方法 基本原理： 將標(biāo)記的特異RNA探針（32P或生物素）與待測(cè)的RNA樣品液相雜交，標(biāo)記的特異RNA探針與目的RNA結(jié)合，形成雙鏈RNA，免受RNA酶的消化；而未結(jié)合的單鏈RNA經(jīng)RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸。核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)原理示意圖32P標(biāo)記的探針：雜交雙鏈進(jìn)行變性PAGE， 用放射自顯影或磷屏成像系統(tǒng)檢測(cè)探針的信號(hào)；生物素標(biāo)記的探針：雜交雙鏈經(jīng)過(guò)變性PAGE后，電轉(zhuǎn)移至尼龍膜，用鏈霉親和素辣根過(guò)氧化物酶和化學(xué)發(fā)光底物與膜上biotin標(biāo)記的探針結(jié)合，X射線膠片或化學(xué)發(fā)光圖像分析儀檢測(cè)雜交信號(hào)。RPA比Northern B

8、lot的優(yōu)勢(shì)：1. 過(guò)量的探針與目的基因的雜交在液相環(huán)境完成，反應(yīng)更加完全 2. RPA比Northern Blot靈敏15-150倍，適合檢測(cè)各種表達(dá)水平之基因 3. RPA通量高，同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因，可評(píng)價(jià)他們?cè)谕磺闆r下的差異表達(dá) 4. 一次RPA就能完成10 多次Northern Blot的工作，加快研究速度可對(duì)細(xì)胞或組織中原位表達(dá)的mRNA進(jìn)行區(qū)域定位標(biāo)記探針特異性地與目標(biāo)靶mRNA序列雜交，檢測(cè)標(biāo)記信號(hào)來(lái)確定基因在組織和細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的區(qū)位信息。可作為定量分析的補(bǔ)充。（六）原位雜交（in situ hybridization，ISH）什么情況下選擇原位雜交？沒(méi)有合適的抗體，不宜做West

9、ern blot檢測(cè)；樣本量太少或比較復(fù)雜，不宜提取RNA或蛋白。原位雜交技術(shù)主要步驟：材料處理及細(xì)胞樣品的固定；樣品的制備和預(yù)處理；探針的制備和預(yù)雜交；探針及樣品的變性；雜交溫育；檢測(cè)雜交信號(hào)，進(jìn)行結(jié)果分析。（七）差異表達(dá)基因篩選方法表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequencing tag，EST) 技術(shù)，1991差異顯示RT-PCR(different display reverse transcription PCR，DDRT-PCR)，1992 抑制性差減雜交(suppression subtractive hybridisation，SSH)，1996 基因芯片(gene ch

10、ip or micrOarray)基因表達(dá)的系列分析(serial analysis of gene expression，SAGE)，1995 基于高通量測(cè)序的數(shù)字基因表達(dá)譜(DGE)分析轉(zhuǎn)錄抑制劑：actinomycin D (ActD), 放線菌素D5,6-dichloro-1D-ribofuranosyl-benzimidazole (DRB),-amanitin (-Am)（八）mRNA穩(wěn)定性分析熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)二、mRNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)的機(jī)制AU-rich elements (AREs) : AUUUA, 7-9% of cellular mRNAsThese elements

11、 are recognized by trans-acting factors, such as mRNA-binding proteins that bind directly or indirectly to the cis-acting elements and promote the deadenylation and degradation of the mRNA.AU-rich element RNA-binding protein 1 (AUF1), tristetraprolin (TTP) ,KH-type splicing regulatory protein (KSRP)

12、embryonic lethal abnormal vision (ELAV)-like protein 1 (HuR) and polyadenylate-binding protein-interacting protein 2 (PAIP2)（1）AU-rich sequences and mRNA binding proteins（2）Regulatory non-coding RNAmiRNAs act by pairing to the mRNAs of protein-coding genes to direct their repression. lncRNAs show di

13、fferent mechanism of action, varying from chromatin remodeling, transcriptional responses and RNA processing.（3）Alternative polyadenylation (APA)APA consist of two steps, cleavage and polyadenylation of RNAs, which are maturation events that cut and add an oligo(dA) tail to the 3 end of the nascent

14、transcript. This processing protects mRNAs from degradation and increases their stability.The specific cleavage position and the efficiency of the process depend on the interaction between trans-acting polyadenylation factors and cis-elements present in the pre-mRNAs, such as the central sequence motif AAUAAA.Most mRNA regulatory elements are situated within the 5 and 3untranslated regions (UTRs).The mRNA stability is regulated by the complex interplay of cis-acting equences within the 3UTR of the mRNA a