講動(dòng)物細(xì)胞生物制藥應(yīng)用舉例

第四篇

生物制品生產(chǎn)

第8講

動(dòng)物細(xì)胞生物制藥第3節(jié)

動(dòng)物細(xì)胞生物制藥應(yīng)用舉例1896192019872006本講主要內(nèi)容1.雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體2.病毒疫苗生產(chǎn)3.海洋生物制藥4.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物制藥的問題與發(fā)展方向本講關(guān)鍵問題1.雜交瘤生產(chǎn)單克隆抗體的制備原理與技術(shù)流程2.滅活病毒疫苗生產(chǎn)流程第一部分雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體新型人源化單克隆抗體可靶向并殺死癌細(xì)胞2013年3月26日PNAS:加州大學(xué)圣地亞哥分校研究人員研制出一種人源化單克隆抗體，可以靶向和直接殺死慢性淋巴細(xì)胞白血病（CLL）細(xì)胞。CLL細(xì)胞高水平表達(dá)一種細(xì)胞表面糖蛋白受體CD44。RG7356的單克隆抗體可以特異性靶向CD44，對(duì)癌細(xì)胞產(chǎn)生直接毒性作用，且對(duì)正常B細(xì)胞影響甚微。單抗藥物相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，單抗藥物2010年全球銷售額達(dá)480億美元，成為銷售額最高的生物制劑。至今，共有29只單抗藥物被FDA批準(zhǔn)上市，而單抗銷售額占整個(gè)生物藥物市場(chǎng)的35%。業(yè)內(nèi)人士預(yù)計(jì)，到2014年，全球前六大暢銷藥物將均為生物技術(shù)藥物，而全球十大暢銷藥物中將有7只是生物技術(shù)藥物，其中6只為重組抗體類藥物。然而，國產(chǎn)單抗產(chǎn)品正處在起步階段，目前已經(jīng)上市的抗體只有9只，絕大多數(shù)在臨床研究或已經(jīng)上市的品種為完全仿制國外上市的產(chǎn)品。有分析預(yù)計(jì)，未來10～20年是我國單抗藥物市場(chǎng)快速增長時(shí)期，單抗仿制藥物在我國面臨巨大的發(fā)展機(jī)遇。問題回顧：什么是細(xì)胞融合？有什么優(yōu)點(diǎn)或作用？細(xì)胞融合（Cell

fusion）是指使用人工方法使兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞合并形成一個(gè)細(xì)胞的技術(shù)。體細(xì)胞雜交：克服有性不親和性，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)源遺傳重組，在育種方面意義重大。雜交瘤細(xì)胞：具有兩親本特性，生物制藥?；A(chǔ)知識(shí)回顧（一）免疫學(xué)基礎(chǔ)1.抗原進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)對(duì)肌體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生刺激作用的外源物質(zhì)。包括：蛋白質(zhì)、多糖、核酸、病毒、細(xì)菌、各種細(xì)胞等。特點(diǎn)：外源性、結(jié)構(gòu)性（分子具有表面具有穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)基團(tuán)作為識(shí)別位點(diǎn)）、特異性（抗原與抗體的反應(yīng)）。2.抗體動(dòng)物免疫系統(tǒng)分泌的中和或消除抗原物質(zhì)的影響的物質(zhì)，存在于血清中，本質(zhì)是免疫球蛋白（Immuniglobulin,Ig）?；パa(bǔ)性決定區(qū)（Complementaritydetermining

region，CDR）

VH和VL的三個(gè)高變區(qū)共同組成Ig的抗原結(jié)合部位（Antigen-bindingsite）。該部位形成一個(gè)與抗原決定簇互補(bǔ)的表面，決定抗體的多樣性與特異性。多克隆抗體與單克隆抗體動(dòng)物脾臟有上百萬個(gè)B淋巴細(xì)胞，一個(gè)細(xì)胞就是一個(gè)克隆，它針對(duì)抗原上的一個(gè)抗原決定族產(chǎn)生的抗體是單克隆抗體。一種抗原通常具有多個(gè)不同的抗原決定族，因此能刺激多個(gè)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的單克隆抗體，因此血清中的抗體是針對(duì)不同抗原決定族的單克隆抗體混合物，稱為多克隆抗體。問題的引出血液得到的只能是混合抗體，但是需要大量的僅針對(duì)某一個(gè)抗原決定族的單克隆抗體，幾乎是不可能的，因此必須采用其他方法。如果我們能分離得到只分泌某一種特異性抗體的B淋巴細(xì)胞，不就可以大量生產(chǎn)相關(guān)單抗了嗎？問題：可以實(shí)現(xiàn)嗎？有什么技術(shù)限制嗎？很難離體培養(yǎng)B淋巴細(xì)胞。

（一）歷史發(fā)現(xiàn)1975年，英國劍橋大學(xué)分子生物學(xué)研究室將已適應(yīng)于體外培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與綿羊紅細(xì)胞免疫小鼠脾細(xì)胞（B淋巴細(xì)胞）進(jìn)行融合，發(fā)現(xiàn)融合形成的雜交瘤細(xì)胞具有雙親細(xì)胞的特征：即像骨髓瘤細(xì)胞一樣在體外培養(yǎng)中能夠無限地快速增殖，又能持續(xù)地分泌特異性抗體。

科勒（Kohler）米爾斯坦（Milstein）（二）雜交瘤技術(shù)將骨髓瘤細(xì)胞與免疫的動(dòng)物脾細(xì)胞融合得到即能夠分泌抗體又能在體外長期繁殖的雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過克隆化培養(yǎng)得到可以分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，這種技術(shù)通稱為雜交瘤技術(shù)（hydridoma

technique）。（三）單克隆抗體應(yīng)用領(lǐng)域單克隆抗體的特點(diǎn)是：理化性狀高度均一、生物活性單一、與抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域：1.作為生物治療的導(dǎo)向武器2.作為免疫抑制劑3.探針4.作為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)試劑5.作為親合層析的配體（四）技術(shù)流程視頻：/v_show/id_XMTY1ODg5MDI0.html1.動(dòng)物免疫與免疫脾細(xì)胞懸液的制備一般要經(jīng)過初次免疫、第二次免役（向動(dòng)物腹腔內(nèi)注射抗體）、加強(qiáng)免疫（向動(dòng)物靜脈內(nèi)注射抗體）三個(gè)過程。如果需要免疫脾細(xì)胞，一般取最后一次加強(qiáng)免疫3天以后的脾臟，制備成細(xì)胞懸液。2.骨髓瘤細(xì)胞的獲得與培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系，這樣雜交融合率高。通常采用HPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）與TK（胸腺嘧啶核苷激酶）缺陷型的骨髓瘤細(xì)胞系。一般在準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞。保證骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期。

3.細(xì)胞融合（1）取對(duì)數(shù)生長的骨髓瘤細(xì)胞，離心，棄上清，用不完全培養(yǎng)液混懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。同時(shí)制備免疫脾細(xì)胞懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。（2）將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗1次，離心，棄上清，用滴管吸凈殘留液體。（3）30秒內(nèi)加入預(yù)熱的一定濃度、一定分子量的PEG，邊加邊攪拌，在室溫下融合。加預(yù)熱的不完全培養(yǎng)液，終止PEG作用。（4）離心，棄上清，用20％小牛血清等輕輕混懸。將融合后細(xì)胞懸液加入96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)。4.融合細(xì)胞的篩選融合的脾細(xì)胞和瘤細(xì)胞、融合的脾細(xì)胞和脾細(xì)胞、融合的瘤細(xì)胞和瘤細(xì)胞、未融合的脾細(xì)胞、未融合的瘤細(xì)胞以及細(xì)胞的多聚體等。正常的脾細(xì)胞在培養(yǎng)基中存活僅5～7天，無需特別篩選，細(xì)胞的多聚體形式也容易死去。剩余：脾細(xì)胞與瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞+未融合的瘤細(xì)胞+融合的瘤細(xì)胞和瘤細(xì)胞，其中后兩種需進(jìn)行特別的篩選去除。HAT培養(yǎng)基篩選法培養(yǎng)基中有三種關(guān)鍵成分：次黃嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基蝶呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T），所以取三者的字頭稱為HAT培養(yǎng)基。篩選原理DNA的合成：正常途徑：糖、氨基酸——核苷酸——DNA

，可以被氨基蝶呤阻斷胸腺嘧啶核苷激酶（TK）補(bǔ)救途徑：核苷酸前體

——核苷酸——DNA

次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HPRT）需要以上兩種酶的參與（1）氨基蝶呤可阻斷細(xì)胞正常途徑合成DNA，因此HAT培養(yǎng)基上的細(xì)胞不能采用該途徑合成DNA。（2）融合所用的瘤細(xì)胞一般是HPRT與TK缺陷型，因此也不能采用補(bǔ)救途徑合成DNA。兩條途徑被阻斷后，有怎樣的結(jié)果呢？瘤細(xì)胞（未融合的和多聚體）命運(yùn)：因不能正常合成DNA而死亡。融合細(xì)胞：具有親代雙方的遺傳性能，具有來自于淋巴細(xì)胞內(nèi)的HPRT與TK

，因此可利用培養(yǎng)基中的嘌呤與嘧啶采用補(bǔ)救途徑合成DNA，因此可在HAT培養(yǎng)基中存活與繁殖。5.克隆化培養(yǎng)將融合的細(xì)胞進(jìn)行充分稀釋，使分配到培養(yǎng)板的每一孔中的細(xì)胞數(shù)在0至數(shù)個(gè)細(xì)胞之間，培養(yǎng)一段時(shí)間后取上清以ELISA法選出抗體高分泌性的細(xì)胞。找出針對(duì)目標(biāo)抗原的抗體陽性細(xì)胞株，增殖后凍存、體外培養(yǎng)或動(dòng)物腹腔接種培養(yǎng)生產(chǎn)抗體。6.分泌抗體的融合細(xì)胞的篩選酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）EILSA主要是基于抗原或抗體能吸附至固相載體的表面并保持其免疫活性，抗原或抗體與酶形成的酶結(jié)合物仍保持其免疫活性和酶催化活性的基本原理。在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)，形成的抗原抗體復(fù)合物，加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。7.單克隆抗體的大量生產(chǎn)（1）實(shí)體瘤法對(duì)數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞按1～3×107cells／ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2

ml。待腫瘤達(dá)到一定大小后(一般10～20天)則可采血，從血清中獲得單克隆抗體含量可達(dá)到1-10mg／ml。采血量有限。（2）腹水制備法腹腔注射1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)5～20mg/ml，

這是目前最常用的方法。（3）生物反應(yīng)器培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)單抗雜交瘤細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)液離心除去細(xì)胞，收集上清液提取抗體。（五）應(yīng)用舉例問題及方向用小鼠制備的鼠源性單抗屬于異源性蛋白，在人體內(nèi)會(huì)引起排異反應(yīng)，有非常嚴(yán)重的毒副作用，制約了其在臨床的廣泛應(yīng)用。人單克隆抗體：生產(chǎn)過程和鼠的單抗一樣，只是采用認(rèn)得B細(xì)胞和人的瘤細(xì)胞。全人單克隆抗體不存在鼠源性異種蛋白的抗原性，不會(huì)被人體免疫系統(tǒng)攻擊，安全。人源化單抗：則是制作出鼠的單抗后，利用基因操作手段，置換或者切除單抗基因中鼠源性的蛋白片斷，弱化其在人體內(nèi)的抗原性，達(dá)到療效。我國首個(gè)人源化單克隆抗體藥物獲準(zhǔn)上市2006年2月24日一種既能阻止關(guān)節(jié)變形、又能有效治療重度銀屑病的新藥：上海中信國健藥業(yè)有限公司自主研發(fā)的抗體類新藥“注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白”（商品名為“益賽普”）上市。它通過特異性地與人體內(nèi)的腫瘤壞死因子（TNF）結(jié)合，對(duì)TNF的活性起負(fù)調(diào)節(jié)作用，從而抑制人體骨關(guān)節(jié)內(nèi)的炎癥反應(yīng)，具有治療起效快、療效顯著的特點(diǎn)。由于采用了“全人源化”的重組融合蛋白，這一新藥不良反應(yīng)小。我國的人源化單抗藥物進(jìn)展腎移植是救治終末期腎病最佳治療選擇，免疫抑制劑在腎移植中的應(yīng)用至關(guān)重要。選擇合理的免疫抑制劑方案，減少毒副反應(yīng)，改善腎移植者長期生存成為新趨勢(shì)。2011年4月，由上海中信國健藥業(yè)股份有限公司自主研發(fā)的人源化單抗健尼哌國內(nèi)正式上市，用于腎移植誘導(dǎo)治療，其可降低急性排斥發(fā)生率：將健尼哌加入基礎(chǔ)免疫抑制方案后，移植后3個(gè)月急排發(fā)生率降低了43.7%，6個(gè)月急排發(fā)生率降低了40.2%；患者1年人腎存活率分別為100%、99.46%。健尼哌上市標(biāo)志著我國抗體藥物研發(fā)水平邁上新臺(tái)階。小結(jié)單克隆抗體藥物第二部分病毒疫苗生產(chǎn)12月1日是什么節(jié)日？艾滋?。焊腥救祟惷庖呷毕莶《荆℉IV）后導(dǎo)致免疫缺陷，并發(fā)一系列機(jī)會(huì)性感染及腫瘤，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡的綜合征。RNA病毒，主要侵犯CD4T細(xì)胞、CD4單核細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞。1959年在剛果發(fā)現(xiàn)。1981年12月1日，美國確認(rèn)發(fā)現(xiàn)一種新的傳染性疾病——艾滋?。ㄈ祟惈@得性免疫缺陷綜合征）。1984年確認(rèn)HIV是引起艾滋病的罪魁禍?zhǔn)?。截?011年，全球有HIV攜帶者3420萬人，僅2011年，就約有170萬人死于艾滋病，其中有23萬為不滿15歲的兒童。加拿大西安大略大學(xué)2012年11月6日宣布，他們研制的艾滋病疫苗在第一階段的人體臨床試驗(yàn)中獲得成功。March

29,

2013Jon

Cohen.

Science

10

May

2013.340.6133.667Science：HIV疫苗

困獸之斗？

SARS事件SARS是指嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥（Severe

AcuteRespiratory

Syndrome，SARS，傳染性非典型肺炎）

。于2002年在中國廣東首發(fā)，并擴(kuò)散至東南亞乃至全球，2003年中期疫情消失。2004年1月19日，SARS病毒滅活疫苗獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)進(jìn)入一期臨床研究，12月5日完成。但是SARS病毒滅活疫苗并沒有產(chǎn)業(yè)化。冠狀病毒（Coronaviruses）SARS——10年后卷土重來2012年6月，埃及微生物學(xué)家Ali

Mohamed

Zaki首次報(bào)告了新冠狀病毒——中東地區(qū)呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）。截止到5月6日，共計(jì)30例新型冠狀病毒感染確診病例，其中18人死亡。新冠狀病毒的死亡率逼近65%，而SARS病毒雖然在全球造成775人死亡，但死亡率卻只有11%。甲型H1N1流感病毒：2009年4月墨西哥豬流感造成數(shù)150多死亡事件，并在多個(gè)國家蔓延。H5N1禽流感：2011年仍有爆發(fā)。H7N9病毒：2013年2月發(fā)現(xiàn)H7N9病毒，由禽類傳播，從上海擴(kuò)散開來，受感染者中近20%會(huì)死亡。據(jù)《華爾街日?qǐng)?bào)》（WSJ）報(bào)道，美國Greffex公司5月2日宣布，成功研發(fā)出了首個(gè)完整的H7N9禽流感疫苗。然而，從小鼠到人，還需經(jīng)過大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、臨床前實(shí)驗(yàn)，再到三個(gè)階段的臨床試驗(yàn)。獲得FDA的批準(zhǔn)。而完成初期臨床試驗(yàn)過程，至少也要幾個(gè)月，長則數(shù)年。成功案例——天花疫苗天花是由天花病毒引起的傳染病。傳染性強(qiáng)、肆虐范圍廣、死亡率高。16-18世紀(jì)，超過60%全球人口遭受天花的威脅。1976年，全球推行天花疫苗接種。1980年5月，世界衛(wèi)生組織宣布根除天花。11月2日：世界肺炎日。全球每年約有160萬人死于肺炎鏈球菌疾病。紅霉素不敏感幾乎達(dá)到100%，青霉素達(dá)86%。1983年肺炎鏈球菌夾膜多糖疫苗PPV23誕生。2000年針對(duì)2歲以下兒童肺炎鏈球菌蛋白結(jié)合疫苗PPV7問世。世界第一大單個(gè)疫苗。其它：疫苗有效控制了麻疹、風(fēng)疹、腮腺炎、白喉、破傷風(fēng)、黃熱病、流感和乙型肝炎等傳染性疾病。（一）分類滅活疫苗：通過化學(xué)、物理或簡(jiǎn)單加熱的方法使病毒失去在宿主體內(nèi)生長復(fù)制的能力，但仍保留了病毒的免疫原性，接種人體后能產(chǎn)生對(duì)此病毒的抵抗力，這種將病毒殺滅后制備的疫苗被稱為滅活疫苗。常用甲醛為滅活劑，滅活病毒核酸而不影響其抗原性。例如：流行性乙型腦炎疫苗、狂犬病疫苗、流感滅活疫苗。減毒活疫苗：采用自然法或人工法通過動(dòng)物傳代或細(xì)胞傳代篩選對(duì)人毒性低的變異株病毒。常見的有脊髓灰質(zhì)炎疫苗、麻疹疫苗、流感溫度敏感突變株疫苗、流行性腮腺炎疫苗、風(fēng)疹疫苗、黃熱病疫苗以及一些聯(lián)合疫苗（如麻疹、腮腺炎、風(fēng)疹聯(lián)合疫苗）。基因工程疫苗、DNA疫苗等。病毒滅活疫苗病毒需要在敏感細(xì)胞中才能增殖。通過動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)繁殖病毒。大致步驟：1.找到病毒敏感細(xì)胞2.進(jìn)行病毒的分離3.病毒生產(chǎn)4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)5.I、II、III期臨床實(shí)驗(yàn)6.滅活疫苗制品

（二）病毒生產(chǎn)方法1.動(dòng)物接種：例如狂犬病毒，采用鼠、兔腦內(nèi)接種后收取腦組織制成懸液。2.雞胚、鴨胚接種：如馬腦炎病毒采用10D齡雞胚接種，收獲全胚體液。3.細(xì)胞培養(yǎng)法：不同的病毒采用相應(yīng)的敏感細(xì)胞，接種一定量的病毒，培養(yǎng)一段時(shí)間，凍融細(xì)胞，離心收獲上清。一般流程：流行性乙型腦炎病毒滅活疫苗制備工藝地鼠腎——剪碎，胰酶消化——地鼠腎細(xì)胞懸浮液——培養(yǎng)——接種病毒感染細(xì)胞——培養(yǎng)2-3天收獲病毒液——甲醛滅活（22度，8天）——滅活病毒液——安全及效力實(shí)驗(yàn)——半成品——分裝——成品

（三）應(yīng)用舉例狂犬病毒（Rabies

Virus）疫苗生產(chǎn)狂犬病是由狂犬病毒（Rabies

Virus）

引起的人畜共患的傳染病狂犬病毒屬于彈狀病毒科彈狀病毒屬。外形呈彈狀，核衣殼呈螺旋對(duì)稱，表面具有包膜，內(nèi)含有單鏈RNA。是引起狂犬病的病原體。

人被患狂犬病的動(dòng)物咬傷、抓傷或經(jīng)粘膜感染均可引起狂犬病。感染者發(fā)病時(shí)呈高度興奮狀態(tài)，并伴有發(fā)熱、頭痛、恐怖不安、驚風(fēng)怕聲、肢體發(fā)麻、吞咽困難，一旦喝水即引起嚴(yán)重痙攣等癥狀，出現(xiàn)恐水現(xiàn)象，故又稱“恐水癥”（hydrophobia）。路易·巴斯德路易·巴斯德（Louis

Pasteur，1822年12月27日－1895年9月28日），法國微生物學(xué)家、化學(xué)家，微生物學(xué)的奠基人之一。倡導(dǎo)疾病細(xì)菌學(xué)說（胚種學(xué)說）和發(fā)明預(yù)防接種方法而聞名，他亦是第一個(gè)創(chuàng)造狂犬病和炭疽的疫苗的科學(xué)家。被視為細(xì)菌學(xué)之祖。早在1885年，路易?巴斯德證明狂犬病毒能通過兔神經(jīng)系統(tǒng)重復(fù)傳代而減毒，并制備出有效的疫苗首次用于人體免疫，從而開創(chuàng)了人用狂犬病疫苗的發(fā)展史?？袢《疽呙绨l(fā)展史1908年Fermi通過在室溫下用1%酚處理腦組織改進(jìn)了巴斯德的方法，但是液中仍有高達(dá)100MLD50的殘余毒力。1911年Semple在此基礎(chǔ)上作了進(jìn)一步改進(jìn)，將腦組織懸液于37℃用酚固定、滅活，制備了無毒性的Semple疫苗。1925年Hempt通過補(bǔ)加乙醚處理，進(jìn)一步確保了疫苗的無毒性。使用Semple疫苗后嚴(yán)重的神經(jīng)麻痹事故的發(fā)生率在1/500-1/2000，這種疫苗目前在發(fā)展中國家仍在廣泛使用。我國自1949年起，一直使用由羊腦制備的Semple疫苗，直至1980年停止使用