細(xì)胞復(fù)蘇與計(jì)數(shù)

細(xì)胞復(fù)蘇從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37～40℃水浴中，快速搖晃直至完全融化（最好在1min內(nèi)完成，融化時(shí)水不要浸過凍存管的蓋子）將凍存管直接離心，1500rpm，5min；棄上清液，加入含10%血清的培養(yǎng)液1ml重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種于新的培養(yǎng)瓶，加入3ml新鮮的培養(yǎng)液，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。注意事項(xiàng)將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí)，要做好防護(hù)工作，以免凍傷；凍存和復(fù)蘇最好用新配制的培養(yǎng)液。細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)法是用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目，以調(diào)整植入的細(xì)胞血細(xì)胞計(jì)數(shù)板是一塊長方形的硬質(zhì)厚玻璃板，板上有兩個(gè)刻度平臺(tái)，每個(gè)平臺(tái)劃分為9個(gè)大方格，每個(gè)大方格的面積為1平方毫米，加特制蓋片（厚度0.7毫米）后的深度為0.1毫米。中心為一個(gè)大方格以雙線等分為25個(gè)中方格，每個(gè)中方格又分為16個(gè)小方格。中心大方格供紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血小板計(jì)數(shù)用，四角的四個(gè)大方格供白細(xì)胞計(jì)數(shù)用。取一套血球計(jì)數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)槽上.將待測細(xì)胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液(10ul)沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。將血球計(jì)數(shù)板置于顯微鏡的低倍鏡下觀察，數(shù)出四角的四個(gè)大格（每個(gè)大格含有16個(gè)中格）中的細(xì)胞數(shù)目。按照下面公式計(jì)算細(xì)胞密度：（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml＝四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4*104*稀釋倍數(shù)說明：公式中除以4因?yàn)橛?jì)數(shù)了4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)。

公式中乘以104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：

1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3＝1*10-4

ml

25格*16格的血球計(jì)數(shù)板RBC計(jì)算公式RBC數(shù)/ml=80小格RBC數(shù)/80*400*104*稀釋倍數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)1.進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104個(gè)/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中。

2.要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。

3.取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其時(shí)多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更要注意每次取樣都要混勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確。

4.數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)，只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞壓在格線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)右線，不計(jì)左線。

5.操作時(shí)，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計(jì)數(shù)。

Zseries細(xì)胞計(jì)數(shù)儀：美國BECKMANCOULTER20ml緩沖液+200ul樣品（101倍）操作步驟A549細(xì)胞一瓶，將培養(yǎng)液去掉，加入D-Hanks3ml使液體覆蓋在細(xì)胞生長面，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，去液體。加入消化液500ul，使消化液覆蓋于細(xì)胞面上。(一般消化時(shí)間為1到5分鐘，以鏡下觀察為準(zhǔn):細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體變圓可終止消化)加入3mlD-Hanks液，輕輕吹打細(xì)胞生長面，使細(xì)胞脫離瓶壁后形成細(xì)胞懸液。吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔不要用力過猛。將細(xì)胞瓶中的細(xì)胞懸液移至15ml離心管中，用D-HANKS將液體總量加至5ml,混勻，吸取200ul細(xì)胞懸液置于1.5ml的EP管中用于計(jì)數(shù)。剩下的細(xì)胞懸液以1500rpm離心5min。去上清，根據(jù)計(jì)數(shù)的結(jié)果用新鮮培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1*105細(xì)胞數(shù)/ml。接種孔板以1*103、2*103、4*103、8*103、1.6*104接種于96孔板中，每個(gè)濃度接種3個(gè)復(fù)孔，最后加3個(gè)空白對(duì)照孔（共18孔），然后每孔加入培養(yǎng)液200ul。將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，在37℃、5%CO2及