免疫金標(biāo)記技術(shù)(研究生講義)

1免疫金標(biāo)記技術(shù)

(Immunogoldlabellingtechique)

2免疫技術(shù)試劑標(biāo)本AgAbAbAg3標(biāo)記免疫技術(shù)試劑標(biāo)本Ag*AbAb*Ag放射性核素?zé)晒馑孛富瘜W(xué)發(fā)光劑膠體金標(biāo)記物技術(shù)放射性核素放射免疫技術(shù)熒光素?zé)晒饷庖呒夹g(shù)酶酶免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光劑化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)膠體金金免疫技術(shù)4金免疫測(cè)定技術(shù)

金免疫組織化學(xué)染色技術(shù)

金免疫技術(shù)斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)金免疫層析試驗(yàn)金免疫光鏡染色技術(shù)金免疫電鏡染色技術(shù)5簡(jiǎn)介

膠體金顆粒具有高電子密度的特性，故在金標(biāo)蛋白的抗原抗體結(jié)合處，顯微鏡下可見(jiàn)黑褐色顆粒；當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的標(biāo)記處大量聚集時(shí)，可在載體膜上呈現(xiàn)肉眼可見(jiàn)紅色或粉紅色斑點(diǎn)(線);

從而用于抗原或抗體物質(zhì)的定位或定性。金免疫組織化學(xué)染色技術(shù)金免疫測(cè)定技術(shù)67制備膠體金制備免疫金建立金免疫測(cè)定技術(shù)8

膠體金的特性膠體金（金溶膠）：是由金鹽被還原成原子金后形成的金顆粒懸液。膠體金的特性膠體性質(zhì)：穩(wěn)定性、對(duì)電解質(zhì)的敏感性光吸收性和呈色性：膠體金的光吸收峰波長(zhǎng)隨顆粒的大小而變化。穩(wěn)定性：影響因素---電解質(zhì)、溶膠濃度、溫度、穩(wěn)定劑9呈色性不同大小的膠體金呈現(xiàn)不同的顏色小顆粒--橙黃色中等顆?！萍t色較大顆?！罴t色大顆粒—紫色10膠體性質(zhì)穩(wěn)定性：穩(wěn)定地、均勻地、呈單一分散狀態(tài)懸浮于液體中111％檸檬酸三鈉加入量（ml）*膠體金特性λmax

呈色

162.00

橙色518nm24.51.50

橙紅522nm411.00

紅色525nm71.50.70

紫色535nm膠體金粒徑（nm）12膠體金的制備化學(xué)還原法:向一定濃度的金溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子變成金原子,形成金顆粒懸液。還原材料：氯金酸（HAuCl4)還原劑：枸櫞酸鹽、白磷、硼氫化鈉、維生素C。。。。最常用的制備方法：枸櫞酸鹽還原法

13

操作要點(diǎn)

配HAuC4水溶液加熱沸枸櫞酸三鈉攪動(dòng)

加熱沸（約2～3min*）冷卻加蒸餾水至原體積

*

見(jiàn)淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色。通過(guò)改變枸櫞酸鈉的用量可制得不同大小的膠體金顆粒14制備膠體金的注意事項(xiàng)（1）玻璃容器必須是最好是經(jīng)硅化處理的。（2）氯金酸對(duì)金屬有強(qiáng)烈的腐蝕性（3）氯金酸易潮解（4）制備膠體金應(yīng)用或者是高質(zhì)量的去離子水。

，不應(yīng)使用金屬藥匙稱量氯金酸。雙蒸/三蒸餾水，絕對(duì)清潔的，，應(yīng)干燥、避光保存。15膠體金的鑒定和保存鑒定

1、清亮透明

2、金顆粒的大小通過(guò)觀察膠體金的顏色，粗略估計(jì)金顆粒的大??；分光光度計(jì)掃描λmax來(lái)估計(jì)金顆粒的粒徑電鏡觀察保存保存于潔凈的玻璃器皿中，室溫或4°C，加入少許防腐劑（如0.02％NaN3）可有利于保存。16優(yōu)質(zhì)劣質(zhì)17免疫金的特性

用于免疫測(cè)定時(shí)膠體金多與免疫活性物質(zhì)（抗原或抗體）結(jié)合，這類(lèi)膠體金結(jié)合物常稱為免疫金復(fù)合物，或簡(jiǎn)稱免疫金（immunogold）。膠體金可以和蛋白質(zhì)等各種大分子物質(zhì)結(jié)合，在免疫組織化學(xué)技術(shù)中，習(xí)慣上將膠體金結(jié)合蛋白質(zhì)的復(fù)合物稱為金探針。物理吸附性：

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-

++++膠體金蛋白質(zhì)18免疫金的制備制備要點(diǎn)PH值的調(diào)整：原則上可選擇待標(biāo)記蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，也可略為偏堿蛋白質(zhì)最適標(biāo)記量的確定標(biāo)記過(guò)程離心純化：超速離心法免疫金最終用稀釋液配成工作濃度保存：穩(wěn)定劑-PEG，BSA19待標(biāo)記蛋白作系列稀釋+定量膠體金+Nacl最適標(biāo)記量：能保持紅色不變而蛋白含量最低的一管蛋白量逐漸減低對(duì)照管20金免疫測(cè)定技術(shù)—

固相膜免疫測(cè)定技術(shù)固相載體：硝酸纖維素膜標(biāo)志物：膠體金斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)（dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA），又稱為滴金免疫測(cè)定法金免疫層析試驗(yàn)

（goldimmunochromatographicassay,GICA）

21斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)

（dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA)

操作示意圖裝置分解圖蓋微孔膜吸水墊料底加標(biāo)本免疫金洗滌液22技術(shù)類(lèi)型：夾心法、間接法

雙抗體夾心法23

間接法

24質(zhì)控雙抗體夾心法：相應(yīng)抗原間接法：反應(yīng)斑點(diǎn)質(zhì)控點(diǎn)人IgG25反應(yīng)線質(zhì)控線陽(yáng)性陰性26操作技術(shù)要點(diǎn)AB27金免疫層析試驗(yàn)（goldimmunochromatographicassay,

GICA)GTC28

夾心法

競(jìng)爭(zhēng)法(抑制法）

間接法金免疫層析試驗(yàn)（goldimmunochromatographicassay,GICA)雙抗原夾心法雙抗體夾心法29雙抗體夾心法G區(qū)：金標(biāo)特異性抗體(兔型)C區(qū)：羊抗兔IgT區(qū)：特異性抗體

吸水紙標(biāo)本陽(yáng)性結(jié)果30競(jìng)爭(zhēng)法標(biāo)本G區(qū)：金標(biāo)特異性抗體(兔型)C區(qū)：羊抗兔IgT區(qū)：標(biāo)準(zhǔn)抗原

吸水紙陽(yáng)性結(jié)果31標(biāo)本G區(qū)：金標(biāo)特異性抗體(兔型)C區(qū)：羊抗兔IgT區(qū)：標(biāo)準(zhǔn)抗原

吸水紙陰性結(jié)果32間接法－反流免疫層析法③⑤合上檢測(cè)盒窗(B)吸水材料(A)金標(biāo)抗人IgG(G0)吸水材料(D)吸水材料(F)標(biāo)本加樣區(qū)(E)包被抗原（T）①②標(biāo)記線(G)④⑥⑥液體流動(dòng)方向包被抗抗體（C）33標(biāo)本CTCT閉合前閉合后E陽(yáng)性結(jié)果34CT35DIGFA與GICA的比較DIGFA（穿透濾過(guò)型）GICA（橫向流動(dòng)型）硝酸纖維素膜的種類(lèi)圓片膜窄長(zhǎng)型膜試劑形式滲濾裝置及2瓶液體試劑（液相形式）單一試劑條(板)（固相形式）操作步驟31觀察時(shí)間操作結(jié)束(約3min)即刻觀察操作結(jié)束后等待3-20min36IFA穿流（FLOWTHROUGH）ICA橫流（LATERALFLOW）37免疫金標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)勢(shì)

示蹤劑：以膠體金為指示劑，本身形成免疫分析過(guò)程后的顏色標(biāo)記自帶質(zhì)控對(duì)照簡(jiǎn)便、快速：全部檢測(cè)過(guò)程僅需3-20分鐘?？蓡畏輽z測(cè)穩(wěn)定性好38

免疫金標(biāo)記技術(shù)的劣勢(shì)靈敏度不如酶標(biāo)技術(shù)一般作為定性，不易定量。金標(biāo)法在臨床中的應(yīng)用實(shí)例1：HBsAg的檢測(cè)實(shí)例2：HCG的檢測(cè)39金免疫組織化學(xué)技術(shù)一、免疫金（銀）光鏡染色技術(shù)二、免疫金電鏡染色技術(shù)40

免疫金銀染色原理示意圖

4142HBsAg診斷試劑試劑盒參考圖示43操作步驟1：洗凈雙手

步驟2：用采血針采指尖血

步驟3：將1滴指尖