植物原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)

在細胞工程中，植物原生質(zhì)體不但是植物細胞雜交良好的親本，而且是植物細胞遺傳工程的理想受體，此外，植物原生質(zhì)體也是細胞生物學研究的很有用的實驗材料。植物原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)是達到這些目的的重要技術基礎，因此，掌握和運用這一技術是十分重要的。第1頁/共50頁第一頁，共51頁。第2頁/共50頁第二頁，共51頁。

二.植物原生質(zhì)體的基本特點與作用

植物原生質(zhì)體是脫掉了細胞壁的、僅有質(zhì)膜包圍、裸露的、活植物細胞。與完整的植物細胞相比，它有下列主要特點：單細胞，在同一時間內(nèi)能得到大量的遺傳上同質(zhì)的原生質(zhì)體，用它可象細菌細胞那樣進行多種遺傳學研究。不親和障礙，為較遠緣的植物細胞雜交提供了融合親本。第3頁/共50頁第三頁，共51頁。二.植物原生質(zhì)體的基本特點與作用外源顆粒，如DNA，質(zhì)粒、病毒、細菌和其它細胞器，因此在植物遺傳工程中有重要作用。4.植物原生質(zhì)體也和植物細胞一樣，具有該植物體的全部遺傳信息，在合適的培養(yǎng)條件下，它能象一粒種子那樣發(fā)育成與其親本相似的新的植物，即具有遺傳全能性。第4頁/共50頁第四頁，共51頁。二.植物原生質(zhì)體的基本特點與作用細胞壁的生物合成提供了方便。細胞膜與信息的傳遞，能量的轉(zhuǎn)換，物質(zhì)的運輸?shù)然粳F(xiàn)象之間的密切聯(lián)系提供了可能。受體，同時又是分離細胞內(nèi)各種細胞器，如細胞核、葉綠體、線粒體等的好材料。見圖1：第5頁/共50頁第五頁，共51頁。第6頁/共50頁第六頁，共51頁。三.植物原生質(zhì)體的材料來源

研究表明，幾乎能從植物的所有部位得到原生質(zhì)體(詳見圖二)，其中以葉片為多，因為植物葉肉細胞的原生質(zhì)體有下面幾個優(yōu)點：1.取材容易，植株可來自盆栽和溫室栽培，也可在試管中培育無菌苗。2.原生質(zhì)體在生理和遺傳特性上比較一致。第7頁/共50頁第七頁，共51頁。三.植物原生質(zhì)體的材料來源3.比較容易用酶解法分離。根尖組織也是植物原生質(zhì)體的重要來源，它可由各種植物的種子萌發(fā)后取得。花粉經(jīng)特異酶處理也能得到原生質(zhì)體，在單倍體遺傳育種中有特殊的用途。第8頁/共50頁第八頁，共51頁。三.植物原生質(zhì)體的材料來源原生質(zhì)體也可以從組織培養(yǎng)的材料中大量獲得。由于組織培養(yǎng)的嚴格條件，使得材料的重復性好，實驗材料可做到常年供應。值得注意的是，在考慮分離植物原生質(zhì)體時，既要采用容易獲得原生質(zhì)體的植物材料，但更重要的是要選用易于再生完整植株的細胞。詳見圖2

第9頁/共50頁第九頁，共51頁。第10頁/共50頁第十頁，共51頁。

四.植物原生質(zhì)體的分離和純化

(一)原生質(zhì)體的分離旱在1892年就有人用機械法分離原生質(zhì)體。直到1960年，英國的科金(Cocking)首先采用酶解法分離原生質(zhì)體，這一重要發(fā)現(xiàn)開辟了細胞工程研究的許多領域，作出了巨大的貢獻。第11頁/共50頁第十一頁，共51頁。四.植物原生質(zhì)體的分離和純化酶解法有下面幾個優(yōu)點：l能獲得大量的原生質(zhì)體；l條件溫和，原生質(zhì)體完整性好；l原生質(zhì)體純凈度高；下面以葉片和懸浮培養(yǎng)的細胞為材料介紹分離原生質(zhì)體的一般步驟：(詳見圖3)第12頁/共50頁第十二頁，共51頁。第13頁/共50頁第十三頁，共51頁。四.植物原生質(zhì)體的分離和純化1.材料的準備與消毒：取充分展開的幼葉，用自來水沖冼干凈后，放入70%灑精中進行表面消毒，再放入2%的次氯酸鈉溶液中處理10分鐘，再用無菌水沖冼3-4次。懸浮培養(yǎng)的細胞一般是用胚性細胞，這有利于原生質(zhì)體的再生。2.酶解：用鑷子撕去葉子的下表皮后，切成2厘米見方的小片，使去表皮的一層朝下放入酶液中處理，在25-28攝氏度，黑暗條件下酶解3-4小時。若采用懸浮培養(yǎng)的細胞，則采用繼代3天的細胞最好，經(jīng)離心收集細胞，放入酶液中置低速轉(zhuǎn)床酶解8-12小時。分離植物原生質(zhì)體常用試劑見表1.第14頁/共50頁第十四頁，共51頁。四.植物原生質(zhì)體的分離和純化第15頁/共50頁第十五頁，共51頁。(二)原生質(zhì)體的純化

植物材料經(jīng)酶解后純化原生質(zhì)體的步驟如下：1.酶解懸浮液用400目的不銹鋼或尼龍網(wǎng)過濾，以除去未消化的碎片。2.將含有原生質(zhì)體的酶液收集到離心管中，低速離心使原生質(zhì)體沉于管底，倒掉上清液。第16頁/共50頁第十六頁，共51頁。(二)原生質(zhì)體的純化3.在離心管中加入適量的洗滌液，并離心。4.重復上述操作三次，使酶解液充分除去，最后用原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗滌一次。上述的離心純化法可細分為：A．沉降法；B．漂浮法；C．沉降法和漂浮法結合等三種。(詳見圖4)

第17頁/共50頁第十七頁，共51頁。四.植物原生質(zhì)體的分離和純化第18頁/共50頁第十八頁，共51頁。第19頁/共50頁第十九頁，共51頁。(三)原生質(zhì)體的活力測定

用于培養(yǎng)和細胞工程操作的必須是健康的有活力的原生質(zhì)體。方法有二：一是憑借形態(tài)可識別原生質(zhì)體的存活性。二是采用特異的染色方法來確定，可用0.1%酚藏花紅液染色，活的原生質(zhì)體能著紅色；最好是采用熒光素雙醋酸酯(FDA)染色。有活力的原生質(zhì)體帶有熒光，無活力的不產(chǎn)生熒光。第20頁/共50頁第二十頁，共51頁。第21頁/共50頁第二十一頁，共51頁。第22頁/共50頁第二十二頁，共51頁。五.影響原生質(zhì)體分離的幾個因素

1.材料不同其細胞壁的組成和結構也有差異。因此分解細胞壁的酶的種類和濃度也不相同，如分離根尖細胞的原生質(zhì)體要有較多的果膠酶。2.滲透壓穩(wěn)定劑的種類和濃度也因材料不同而有變化。3.在酶液中加入適量的氯化鈣和磷酸二氫鉀作為原生質(zhì)體穩(wěn)定劑，可增強質(zhì)膜的穩(wěn)定性。第23頁/共50頁第二十三頁，共51頁。五.影響原生質(zhì)體分離的幾個因素pH值也直接影響分離的速度和穩(wěn)定性。pH值低則分離速度較快，而損壞的較多；pH值高則分離速度較慢，而完整性較好；故酶液的pH值一般為57左右。5.取材植株的生理狀態(tài)也是重要的因素，如采用懸浮培養(yǎng)的細胞一般用繼代三天的較為理想。(詳見表二)第24頁/共50頁第二十四頁，共51頁。六.培養(yǎng)原生質(zhì)體的幾種方法

原生質(zhì)體經(jīng)分離和純化后，需要進行活力測定和計數(shù)。原生質(zhì)體培養(yǎng)時有一種密度效應，一般在每毫升培養(yǎng)液中應有10個左右的原生質(zhì)體有利于培養(yǎng)。計數(shù)可用血球計數(shù)板進行。常用的原生質(zhì)體培養(yǎng)方法有以下幾種：(詳見圖5)1.液體培養(yǎng)法：是把純化后的原生質(zhì)體懸浮于液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)方法。又可分為液體淺層培養(yǎng)法和液體懸滴法二種。第25頁/共50頁第二十五頁，共51頁。六.培養(yǎng)原生質(zhì)體的幾種方法2.固體平板法：它是把原生質(zhì)體均勻地埋入瓊脂培養(yǎng)基中的培養(yǎng)方法。3.雙層培養(yǎng)法：是在瓊脂培養(yǎng)基上部加入一薄層液體原生質(zhì)體培養(yǎng)液的培養(yǎng)方法。4.瓊脂糖包埋法：同固體平板法。詳見圖5第26頁/共50頁第二十六頁，共51頁。六.培養(yǎng)原生質(zhì)體的幾種方法第27頁/共50頁第二十七頁，共51頁。七.植物原生質(zhì)體的發(fā)育和植株再生

植物原生質(zhì)體在培養(yǎng)過程中，一般要經(jīng)過下面幾個不同的階段：1.細胞壁再生：2.細胞分裂：3.愈傷組織或胚狀體的形成：4.植株再生：有二條途徑，一是從愈傷組織誘導形態(tài)發(fā)生；二是誘導胚狀體。第28頁/共50頁第二十八頁，共51頁。第29頁/共50頁第二十九頁，共51頁。第30頁/共50頁第三十頁，共51頁。八.原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合，也叫體細胞雜交，就是使分離出來的不同親本的原生質(zhì)體之間在人工控制的條件下，像性細胞受精作用那樣互相融合成一體。受精作用是一種自發(fā)的融合，而原生質(zhì)體由于質(zhì)膜表面帶有負電荷，它們之間通常是相互排斥的，所以自然融合頻率極低。所以要采用一定的方法加以誘導以促進原生質(zhì)體的融合。第31頁/共50頁第三十一頁，共51頁。八.原生質(zhì)體融合第32頁/共50頁第三十二頁，共51頁。八.原生質(zhì)體融合第33頁/共50頁第三十三頁，共51頁。八.原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體的融合過程第34頁/共50頁第三十四頁，共51頁。八.原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體的融合過程第35頁/共50頁第三十五頁，共51頁。八.原生質(zhì)體融合第36頁/共50頁第三十六頁，共51頁。八.原生質(zhì)體融合（一）原生質(zhì)體融合的方法1.無機鹽誘導融合用來做融合劑的無機鹽是硝酸鈉，1972年Carlsony就是用它來融合煙草的原生質(zhì)體，并首次獲得種間的體細胞雜種。其原理是硝酸鈉的作用是中和了質(zhì)膜的負電荷，使原生質(zhì)體不再相互排斥，而緊密結合在一起，但硝酸鈉對原生質(zhì)體有害作用，且誘導頻率也很低，所以目前很少有人采用。第37頁/共50頁第三十七頁，共51頁。第38頁/共50頁第三十八頁，共51頁。八.原生質(zhì)體融合2.聚二乙醇（PEG）與高pH的Ca2+相結合的誘導融合法（1）以常規(guī)的方法收集原生質(zhì)體，將兩親本的原生質(zhì)體高密度等體積混合。（2）滴3滴混合的原生質(zhì)體懸浮液于載玻片上，放置10分鐘。（3）加PEG450μL。PEG的制備方法：1gPEG加入的2mlmol/Lmmol/LCaCl2mmol/LKH2PO4溶液中，再放置10－20分鐘。第39頁/共50頁第三十九頁，共51頁。八.原生質(zhì)體融合(4)ml高Ca2+、高pH溶液，間隔10分鐘再加一次。其組成是50mmol/LCaCl2、50mmol/L的甘氨酸鈉，pH10.5。(5)加1ml原生質(zhì)體培養(yǎng)基洗滌，洗滌5次，每次間隔5分鐘。(6)最后加300--500μL原生質(zhì)體培養(yǎng)基，以微滴形式培養(yǎng)。第40頁/共50頁第四十頁，共51頁。八.原生質(zhì)體融合用此方法的誘導頻率可以高達10%--50%。并無種屬特性，幾乎可以誘導任何原生質(zhì)體之間的融合。其原理是PEG是一種略帶負電的高分子化合物，在原生質(zhì)體的融合中起到一種橋的作用，可以使原生質(zhì)體凝聚，而鈣離子的加入會在質(zhì)膜與PEG中間起到連接作用。在洗脫PEG過程中，會導致質(zhì)膜表面電荷重排。由于粘連的質(zhì)膜大面積緊密相連，這種電荷的重排會導致一個原生質(zhì)體的負性電荷部分與另一個原生質(zhì)體的正電荷部分相連而導致融合。第41頁/共50頁第四十一頁，共51頁。P1P2P1P2高Ca2+高pH融合洗滌培養(yǎng)選擇混合靜止1min加入PEG加入培養(yǎng)基融合技術要點：第42頁/共50頁第四十二頁，共51頁。第43頁/共50頁第四十三頁，共51頁。電場下形成原生質(zhì)體凝聚體

第44頁/共50頁第四十四頁，共51頁。八.原生質(zhì)體融合3.電融合技術就是使用電融合儀，其優(yōu)點在于避免了PEG、高鈣離子，高pH強加于原生質(zhì)體的生理非常條件，同時融合的條件更加數(shù)據(jù)化，更便于控制和相互比較。交變電流的強弱、處理時間的長短、電泳沖的大小等因素對融合的效果都有明顯的影響。第45頁/共50頁第四十五頁，共51頁。第46頁/共50頁第四十六頁，共51頁。第47頁/共50頁第四十七頁，共51頁。八.原生質(zhì)體融合（二）雜種細胞的選擇與細胞雜種的鑒定雜種細胞的選擇方法（1）培養(yǎng)基促進異核體生長的選擇方法（2）葉綠素缺失互補選擇法（3）機械分離，肉眼分辯法（4）雙突變系選擇法（5）熒光標記選擇法第48頁/共50頁第四十八頁，共51頁。八.原生質(zhì)體融合2.體細胞雜種的鑒定這種鑒定不但在于確認細胞雜種的雜種性，而且必須弄清楚融合親本的雙方各貢獻了哪些遺傳成分，因為在雜種細胞發(fā)育成完整植株的過程中，往往有一方的染色體更易消減掉。（1）形態(tài)學鑒定（2）細胞學鑒定（3）DNA內(nèi)切圖譜分析第4