鐵皮石斛的抗氧化、保濕功效研究和應用現(xiàn)狀

鐵皮石斛的抗氧化、保濕功效研究和應用現(xiàn)狀陳漪汶，文霞，黃健聰，張淑瑤，鄭雅莉，2，謝小保

(1廣東省科學院微生物研究所，廣東省微生物分析檢測中心，華南應用微生物國家重點實驗室，廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣東廣州510070；2廣東迪美新材料科技有限公司，廣東肇慶526238)

鐵皮石斛，隸屬蘭科石斛屬，常生長于海拔達1000多米的山地，喜溫暖濕潤氣候和較為陰濕的環(huán)境，在我國主要分布在安徽、浙江、廣西等地[1]。鐵皮石斛被奉為中華九大仙草之首，是《中華人民共和國藥典》中明確記載的5種石斛屬植物之一。

鐵皮石斛的神奇功效在中國古代醫(yī)學典籍中已有多處詳細的記載，如在《本草綱目》中稱鐵皮石斛具有增強機能，調(diào)理腸胃等功效。在美容方面，鐵皮石斛也呈現(xiàn)出優(yōu)越的抗氧化、抗衰老、保濕、抗炎等多重護膚功效[2]。當下中國化妝品市場主流趨勢為：天然、綠色、功效護膚。因此，鐵皮石斛在化妝品領域的潛在應用價值受到了國內(nèi)外研究者們的廣泛重視。尤其是近年來，鐵皮石斛的護膚功效和應用研究儼然成為了當前化妝品開發(fā)的一個新熱點。

1鐵皮石斛多糖及其功效

1.1鐵皮石斛多糖

鐵皮石斛最主要的活性成分是多糖類，也是衡量鐵皮石斛品質(zhì)優(yōu)劣的一項重要指標。與其它品種的石斛相比，鐵皮石斛在多糖含量方面占據(jù)絕對優(yōu)勢?！吨袊幍洹分幸?guī)定，鐵皮石斛多糖含量不得少于25.0%。鐵皮石斛含有高濃度的粘液多糖，鐵皮石斛中多糖積累越多，則粘度越高，相應的多糖活性就越強，產(chǎn)品也更優(yōu)質(zhì)[3]。

不同產(chǎn)地、不同采收時期、不同部位的鐵皮石斛多糖含量各異。如鐵皮石斛莖中多糖含量約為鐵皮石斛葉的2～4倍[4-5]；其次，代謝水平會影響多糖得率，如鐵皮石斛在4月份左右(開花前)采收可獲得更高含量的鐵皮石斛多糖，相對應地，二年生的鐵皮石斛更容易達到多糖標準含量的要求[5]。

鐵皮石斛中多糖成分有葡甘露聚糖，可占粗多糖組分干重的58.3%。其單糖組成主要包括甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和鼠李糖等[6-7]。He等[7]從鐵皮石斛莖中提取的水溶性多糖，其含量高達367mg/g。經(jīng)水解和HPLC分析可知，水溶性多糖的主要單糖成分為甘露糖，其含量為257mg/g，葡萄糖和半乳糖次之，其含量分別為55mg/g和1mg/g，這表明鐵皮石斛水溶性多糖主要為甘露聚糖。鐵皮石斛葉中以酸性雜多糖居多，經(jīng)HPLC-ESI-MS鑒定可知，14個不同產(chǎn)地的鐵皮石斛多糖相對含量差異較大，但其單糖構(gòu)成相似，均以葡萄糖、甘露糖、半乳糖為主，其中尤以甘露糖占比最多[4]。鐵皮石斛葉經(jīng)熱水提取、醇沉和色譜柱處理后，可分離出兩種平均分子量分別為28，342Da和41，143Da的多糖組分DLP-1和DLP-2。由GC-MS分析得知，DLP-1的單糖摩爾比為半乳糖:阿拉伯糖:鼠李糖=3.21:1.11:0.23；DLP-2的單糖摩爾比為葡萄糖:半乳糖=3.23:1.02[8]。Luo等[9]通過水提醇沉法提取，并進一步采用層析技術分離出一種分子量為8500Da的鐵皮石斛多糖DOP，其單糖摩爾比為甘露糖:葡萄糖:阿拉伯糖與:半乳糖醛酸=6.2:2.3:2.1:0.1。原子力顯微鏡表明，DOP主要以棒狀鏈形式存在，有利于多糖高聚合度結(jié)構(gòu)。

1.2鐵皮石斛多糖的抗氧化功效

情緒和身體壓力、不良飲食習慣、環(huán)境污染等都可能會導致機體中自由基失衡，當自由基在人體內(nèi)累積過多時，自由基會打破生物體內(nèi)的代謝平衡，導致皮膚老化和其他皮膚疾病[10]。內(nèi)源性抗氧化劑可能不足以抵消自由基的負面影響，而天然抗氧化劑具有來源廣泛、天然無毒、安全高效等優(yōu)勢，這引起了業(yè)內(nèi)對天然抗氧化劑極大的興趣和關注[11]。大量研究表明，天然多糖、維生素、多酚類等成分都有清除生物體內(nèi)自由基的體內(nèi)外抗氧化活性。

已有文獻報道，鐵皮石斛多糖可通過阻斷自由基反應鏈、增強機體的抗氧化防御系統(tǒng)、下調(diào)炎癥相關因子的表達等來發(fā)揮抗氧化作用[12]。Huang等[13]采用H2O2誘導巨噬細胞氧化損傷模型來評估鐵皮石斛多糖的抗氧化能力，結(jié)果表明，鐵皮石斛多糖能顯著提升巨噬細胞活力，降低細胞凋亡率和病變率。這證實了鐵皮石斛多糖對氧化損傷具有溫和的免疫刺激活性和保護作用，這種生物活性可能與其(1→4)-β-D-Manp、O-乙?；冉Y(jié)構(gòu)以及高比例的甘露糖組成有關。

Luo等[9]的研究顯示，當鐵皮石斛多糖DOP的濃度為50-800μg/mL時，隨著DOP的濃度增加，DOP的螯合能力由6.3%提升至85.2%，這表明DOP能夠通過螯合作用來抑制Fe2+介導的氧化反應鏈。Xing等[14]采用Fe3+還原和·O2-、DPPH和·OH自由基清除試驗來綜合評估四種鐵皮石斛多糖組分DOP-40、DOP-50、DOP-60和DOP-70的體外抗氧化活性。結(jié)果表明，DOP-70組分的抗氧化能力最強。當作用濃度為5mg/mL，DOP-70的還原能力能達到抗壞血酸的76.4%，對O2-、DPPH和·OH的清除率分別為65.3%、70.3%、69.5%，相應的IC50值為2625.6μg/mL、2395.8μg/mL、2081.7μg/mL。水提醇沉脫蛋白處理后的鐵皮石斛粗多糖經(jīng)H2O2-Vc-Fe2+降解得到6種多糖組分，這7種多糖(含降解前后的多糖成分)的分子量從11.10kDa到652.29kDa不等，所有DOPs均呈劑量依賴性地表現(xiàn)出良好的DPPH、·OH自由基清除能力。其中，分子量最大的活性多糖顯現(xiàn)出了最好的抗氧化活性，這表明DOPs對DPPH、·OH的清除能力與其分子量之間存在一定的聯(lián)系[15]。

核因子紅系2相關因子2(NRF2)信號通路是減輕ROS的氧化損傷、抑制胃癌(PLGC)擴散的重要途徑。在MNNG誘導大鼠PLGC模型中，給予一定劑量的DOP能夠顯著上調(diào)NRF2及其下游II期解毒酶HO-1和NQO-1的表達，通過清除ROS來削弱對機體的氧化損傷，結(jié)果也證實了給藥處理后的氧化損傷標志物8-OHdG水平確實顯著降低[16]。

王玲等[17]從組織培養(yǎng)和野生的鐵皮石斛中提取得到的粗多糖類物質(zhì)均呈濃度依賴性地表現(xiàn)出清除自由基以及抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)生成的體外抗氧化活性。研究表明，給果蠅喂食一定劑量的鐵皮石斛多糖，30天后果蠅體內(nèi)的兩種抗氧化酶SOD和CAT活力均顯著升高，且MDA積累減少，果蠅的平均壽命和逆爬行能力均相應得到提升[18]。

1.3鐵皮石斛多糖的保濕功效

皮膚是人體最大的器官，皮膚存在著一個天然的保濕系統(tǒng)。角質(zhì)細胞是表皮層中的主要細胞類型，含有天然保濕因子(NMF)，NMF主要由氨基酸及其衍生物組成，在皮膚保濕方面發(fā)揮重要作用。保濕是維持皮膚健康的必要條件。角質(zhì)層的水分含量一般維持在10%～20%之間，當角質(zhì)層的水分含量低于10%時，皮膚會變得粗糙、干裂、松脆而缺乏彈性[19-20]。因此，一切護膚型化妝品的最基本功效是保濕。而多糖類物質(zhì)含有大量的親水性羥基，吸水性強，且具有良好的成膜性，可有效鎖水保濕，因而被廣泛應用于護膚產(chǎn)品的保濕成分。目前市面上的護膚產(chǎn)品大多數(shù)是添加透明質(zhì)酸、甘油、膠原蛋白等保濕成分[21-22]。

研究證實，鐵皮石斛多糖提取物與透明質(zhì)酸的保濕效果沒有明顯差別，6h內(nèi)能達到50%吸濕率；人體功效評價實驗結(jié)果表明，添加了20μg/mL鐵皮石斛提取物的化妝品就有較為明顯的保濕效果；體外細胞實驗結(jié)果表明，添加劑量為200μg/mL鐵皮石斛提取物的保濕效果與1000μg/mL透明質(zhì)酸鈉相近，且細胞活力可恢復至60%以上。這證明了鐵皮石斛提取物起到抵御干燥作用，有助于形成保護屏障[23]。實驗結(jié)果表明，鐵皮石斛多糖溶液在6h內(nèi)表現(xiàn)出與同等質(zhì)量比的甘油相當?shù)谋裥Ч?，添加?.5%鐵皮石斛多糖的保濕水與未添加組相比含水量和油分改善率均增加了5%，表現(xiàn)出更優(yōu)的保濕性能[21]。

2鐵皮石斛酚類化合物及其功效

2.1鐵皮石斛酚類化合物

鐵皮石斛含有黃酮、聯(lián)芐、菲、蒽醌和倍半萜等酚類物質(zhì)，是發(fā)揮抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用的主要功效成分[24]。這類化合物中的酚羥基結(jié)構(gòu)具有強還原性，能作供氫體淬滅自由基，因此酚類可作為天然抗氧化劑應用于各類護膚產(chǎn)品中，以減少氧化損傷帶來的皮膚問題[25]。

鐵皮石斛不同器官各司其職，因此各大類代謝產(chǎn)物含量差異較大。比如，與莖相比，鐵皮石斛葉能夠積累更多的多酚類代謝產(chǎn)物[26]。鐵皮石斛黃酮含量大小順序為花>葉>莖>根部[27]。不同產(chǎn)地由于氣候、光照等環(huán)境條件不同，也會造成鐵皮石斛黃酮類化合物在組成和含量上的差異[28]。

Zhou等[28]從不同產(chǎn)地的25種鐵皮石斛中分離鑒定出7種黃酮C-苷和2種黃酮O-苷。結(jié)果表明，部分黃酮苷成分具有地域性。不同產(chǎn)地鐵皮石斛黃酮苷含量存在差異。比如異佛萊心苷僅在廣南地區(qū)檢出，浙江本地鐵皮石斛中不含蘆丁。因此異佛萊心苷和蘆丁可作為區(qū)分來源的標志性成分。鐵皮石斛各部位黃酮類成分構(gòu)成相近，且都以芹菜素類居多[29]。Zhang等[24]從11種鐵皮石斛葉片的甲醇提取物中鑒定出了14種酚類成分，包括蘆丁、維采寧-2、異夏佛托苷等，其中僅有蘆丁為槲皮素型黃酮醇，其他均為芹菜素型黃酮，其分子量從534.47～610.52Da不等。其中，蘆丁含量與總黃酮量之間存在較強的正相關關系，這表明蘆丁是鐵皮石斛葉中最主要的黃酮類成分。

2.2酚類化合物的抗氧化功效

研究表明，鐵皮石斛葉的甲醇提取物對DPPH的清除作用與總黃酮含量之間存在較強的正相關關系。DPPH/ABTS+-HPLC-UV篩選試驗證明，蘆丁是最主要的抗氧化成分，甲醇提取物DPPH自由基清除率與蘆丁含量存在明顯的線性關系。鐵皮石斛葉中高含量的芹菜素類黃酮也具有清除DPPH/ABTS+的體外抗氧化活性[24]。

李燕等[30]從鐵皮石斛中分離出了17種酚類化合物并測試其體外抗氧化活性。結(jié)果表明，二氫黃酮類等特殊結(jié)構(gòu)的酚類物質(zhì)能表現(xiàn)出較強的DPPH清除能力，甚至能達到與Vc相近的處理效果。Li等[31]從鐵皮石斛莖中分離出的聯(lián)芐衍生物——dendrocandinE能表現(xiàn)出比Vc更強的DPPH清除效果。體外抗氧化試驗結(jié)果表明，從云南產(chǎn)鐵皮石斛葉中所分離出的黃酮類成分牧荊葡基黃酮-2″-O-鼠李糖苷具有清除DPPH、ABTS+的體外抗氧化活性，可削弱·OH導致的MSC細胞氧化損傷[32]。邵尉采用加熱回流法提取的鐵皮石斛花黃酮含量為1.74%，在相同濃度條件下對DPPH、·OH的清除效果優(yōu)于Vc，其IC50值分別為0.4μg/mL和25.8μg/mL；鐵皮石斛莖黃酮和葉黃酮含量分別為0.05%、0.20%，在相同濃度條件下對·OH的清除效果優(yōu)于Vc，其IC50值為12.1μg/mL和18.3μg/mL；鐵皮石斛花、葉、莖黃酮提取物均表現(xiàn)出Vc更強的還原力，其自由基清除能力也遠高于多糖提取物[33]。

3其他生物活性成分及功效

鐵皮石斛富含多種氨基酸成分，基本涵蓋了所有的人體必需氨基酸和非必需氨基酸。曲繼旭等[34]對鐵皮石斛等三種石斛的氨基酸進行分析得出，鐵皮石斛氨基酸含量為40.983mg/g，高于多數(shù)蔬菜水果；必需氨基酸占比為32.55%。因此，鐵皮石斛是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白來源和天然的保濕成分。鐵皮石斛中還含有具抗氧化、抗炎、抑菌效用的生物堿成分，能協(xié)同增強機體抗氧化能力。鐵皮石斛中生物堿主要包括大麥芽堿、異柚葡糖苷、哌啶、奎寧、異半卟啉、甜菜堿、可可堿和葫蘆巴堿等，其含量為0.0190%～0.0430%[26-35]。此外，鐵皮石斛還富含人體所需的各種礦物元素，其含量多高于其他中草藥成分，有利于與其他生物活性成分協(xié)同發(fā)揮效用[36-37]。但目前國內(nèi)外鐵皮石斛對其他活性成分關注較少，其具體功效機制尚不明晰。

4提取工藝對功效的影響

提取工藝直接影響鐵皮石斛提取物的質(zhì)量、功效成分的提取率、純度、生物活性，進而導致提取物有效成分濃度和實際作用效果的差異。

4.1多糖類的提取工藝

熱水浸提是最常用的鐵皮石斛多糖提取方法，但傳統(tǒng)熱水浸提法存在浸提時間長、用水量大等局限性，為了提高提取效率通常其他方法聯(lián)合使用，比如超聲法、微波法、生物酶解法等。

繆園欣等[38]采用超聲波-微波協(xié)同輔助提取鐵皮石斛花多糖并評估其抗氧化功效。當提取體系料液比為1:50(g/mL)，超聲處理時間為55min，微波處理功率和時間分別為450W、3min時，多糖的提取效率達到最高。經(jīng)測試，鐵皮石斛花多糖提取物具有強大的DPPH清除能力，其IC50值小于0.1mg/mL，與Vc相近。超聲波、微波的機械效應可以快速縮短提取時間，增加凈產(chǎn)出。但該方法經(jīng)實踐后所得到的鐵皮石斛多糖產(chǎn)率卻偏低(7.22%)，這可能與超聲的改性作用有關。

薛燕等[39]采用復合酶法提取鐵皮石斛多糖并展開了系統(tǒng)的工藝優(yōu)化。當提取體系料液比為1:120，初始pH為6.0，復合酶(中性蛋白酶和纖維素酶)濃度比為2:1，酶添加量為10%時，在55℃下累計酶解3h后可收獲43.85%鐵皮石斛多糖；與水提法相比，酶法提取的鐵皮石斛多糖能表現(xiàn)出更優(yōu)越的DPPH、ABTS+清除能力。李堅等[40]采用乳酸菌發(fā)酵提取鐵皮石斛多糖并展開了系統(tǒng)的工藝優(yōu)化。當投料比為1%(g/mL)，發(fā)酵液初始pH為6.0時，在37℃下累計發(fā)酵72h后可收獲45.5%鐵皮石斛多糖。通過人體試驗評估鐵皮石斛多糖提取物的保濕功效，結(jié)果顯示，在持續(xù)使用添加發(fā)酵鐵皮石斛多糖的樣品28天后，志愿者們的肌膚含水量顯著提高了48.01%。與其他提取方法相比，酶提法可有效增加細胞壁的通透性，有利于功效成分的流出和提取，兼具溫和、安全、高效的優(yōu)勢。而微生物發(fā)酵法則為鐵皮石斛提取提供一個新方向，微生物中豐富的酶系可加速鐵皮石斛細胞壁的破壞和胞內(nèi)活性物質(zhì)的釋放，且可通過生物轉(zhuǎn)化降解潛在的有害物質(zhì)，并生成有益的次生代謝產(chǎn)物，有利于提高鐵皮石斛功效成分的提取率和活性[41]。有研究表明，鐵皮石斛多糖經(jīng)微生物發(fā)酵后可降解為低聚糖或單糖，增加體系中羥基的暴露量，增強了其抗氧化活性[42]。

Liang等[43]以氯化膽鹼和甘油配制的深共晶溶劑作為提取劑，采用酶輔助提取鐵皮石斛多糖，結(jié)果表明，以深共晶溶劑作提取劑比水提能獲得更高產(chǎn)量的鐵皮石斛多糖，在保證其抗氧化活性的同時，還兼具環(huán)保、性能穩(wěn)定等優(yōu)勢。對提取工藝進行單因素優(yōu)化，結(jié)果顯示，當氯化膽鹼和甘油摩爾比、提取溫度、提取時間、酶濃度分別為1:8、30℃、120min、6mg/mL時，鐵皮石斛多糖產(chǎn)率最高。

He等[44]綜合比較了不同提取方法對鐵皮石斛莖多糖提取效果的影響。結(jié)果表明，采用凍融冷壓法提取得到的多糖產(chǎn)量較高，可達到20.33%，這可能是頻繁的冷凍和快速解凍促進了細胞壁的破壞和溶解。經(jīng)表征得知，采用凍融冷壓法的鐵皮石斛多糖中碳水化合物含量較高，且不含硫酸鹽、蛋白質(zhì)和糖醛酸。HPGPC結(jié)果表明，采用凍融冷壓法的鐵皮石斛多糖分子鏈完整強，且其清除ABTS+、H2O2和螯合Fe2+的抗氧化活性最好，尤其是在H2O2清除能力方面遠遠勝過強抗氧化劑Vc。

4.2酚類化合物的提取工藝

鐵皮石斛中酚類物質(zhì)的提取對溶劑的選擇有一定的要求，多采用有機溶劑進行提取以減少水溶性成分的干擾。一般采用的提取技術有加熱回流法、超聲波、微波輔助提取、生物酶解法等。

黃琴等[25]測試了乙醇、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇這四種有機溶劑對鐵皮石斛的黃酮和多酚類物質(zhì)提取效率及其抗氧化作用的影響。結(jié)果顯示，氯仿提取物中總酚(以沒食子酸定量)和黃酮效價最高，分別為4.10%和10.45%；且能表現(xiàn)出最強的ABTS+、DPPH清除活性和還原能力。Lu等[45]系統(tǒng)地優(yōu)化了鐵皮石斛黃酮提取工藝并評估其抗酪氨酸酶活性。經(jīng)優(yōu)化后，體系中固液比為1:50(g/mL)，乙醇溶劑的濃度為78%，期間分6次提取，提取時間設定為2h，在此條件下總黃酮含量可達到0.7g/L。經(jīng)測試，與β-熊果苷相比，所得到的總黃酮提取物能表現(xiàn)出更強的酪氨酸酶抑制活性，且對單酚酶活性的抑制效果強于二酚酶。這可能是因為黃酮提取物可以通過終止自由基反應鏈從而削弱自由基介導的L-酪氨酸酶對L-酪氨酸的催化作用。

高海立系統(tǒng)地優(yōu)化了鐵皮石斛葉黃酮的超聲輔助復合酶法提取工藝。經(jīng)優(yōu)化后，體系中液料比為30:1(V/m)，乙醇溶劑的濃度為45%，超聲處理功率和時間分別為100W、10min；復合酶(纖維素酶和木瓜蛋白酶)濃度比1.5:1，酶濃度為1%、反應溫度為55℃、反應時間為60min，相應的葉黃酮得率能達到1.81%。經(jīng)測試，葉黃酮提取物均呈濃度依賴性地表現(xiàn)出對DPPH、·OH、ABTS+的清除能力，以及還原Fe3+、螯合Fe2+的體外抗氧化活性；經(jīng)大孔樹脂純化后的葉黃酮純度和含量均得到顯著提升，其抗氧化活性也明顯增強[46]。Lin等[42]系統(tǒng)比較了鐵皮石斛經(jīng)混合菌發(fā)酵前后的提取物質(zhì)量的變化。將酵母菌、乳桿菌和枯草芽孢桿菌按照1:1:1的比例混合加入提取體系中，經(jīng)過3天的發(fā)酵，鐵皮石斛提取物中黃酮、多酚含量分別提升了118.20%和128.17%，·OH、DPPH、ABTS+的清除率也相應提高了43.03%、60.05%和94.87%。這表明混合菌發(fā)酵可有效提高鐵皮石斛酚類物質(zhì)的提取效率和體外抗氧化活性。

5鐵皮石斛在化妝品中的應用

近年來，基于化學合成品對人體皮膚可能存在的副作用，使用更安全、高效的天然生物提取成分在化妝品行業(yè)中已成為一種不可抵擋的趨勢?，F(xiàn)如今，越來越多的人將目光轉(zhuǎn)移到鐵皮石斛系列化妝品的開發(fā)應用，如保濕水、精華素等，這迎合了當下化妝品行業(yè)對“綠色、天然、無刺激”健康護膚理念的熱切追求。

李曉嬌等[47]以鐵皮石斛為原料研發(fā)了一種面膜產(chǎn)品，其感官性能和理化質(zhì)量均能符合QB/T2872-2022標準的規(guī)定。該面膜產(chǎn)品可達到77.20%保濕率和25%以上的DPPH清除率，具有保濕、抗氧化的功效，且使用感不黏膩、易涂抹吸收。程建華等[48]