前言EGFP基因的克隆及表達(dá)

前言EGFP基因的克隆及表達(dá)第1頁(yè)/共8頁(yè)綠色熒光蛋白(green-fluorescentprotein,GFP)是從太平洋水母中分離出來(lái)的一種熒光蛋白質(zhì),為238氨基酸組成的單體,分子量約為27kD。其野生型(wild-typeGFP)的吸收/激發(fā)峰在395nm,在475nm有一個(gè)次要峰，發(fā)射峰為508nm。對(duì)細(xì)胞無(wú)毒，用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)的檢測(cè)。綠色熒光蛋白(GFP)第2頁(yè)/共8頁(yè)GFP的應(yīng)用特點(diǎn)：1、檢測(cè)方便：不需要外加底物和輔助因子，用熒光顯微鏡甚至肉眼就可以觀察到，且靈敏度高，對(duì)于單細(xì)胞水平的表達(dá)也可識(shí)別。2、熒光穩(wěn)定：GFP對(duì)光漂白有較強(qiáng)的耐受性，能耐受長(zhǎng)時(shí)間的光照；在pH范圍在7-12之間都能正常發(fā)光；對(duì)高溫、堿、離子除垢劑、鹽、有機(jī)溶劑和大多數(shù)普通酶都有較強(qiáng)抗性。3、無(wú)毒害：GFP對(duì)生活的細(xì)胞基本無(wú)毒害,對(duì)目的基因的功能也沒(méi)有影響,轉(zhuǎn)化后細(xì)胞仍可連續(xù)傳代。4、具有共用性和通用性：首先表現(xiàn)在GFP的表達(dá)幾乎不受種屬范圍的限制，在微生物、植物、動(dòng)物中都獲得了成功的表達(dá)；其次是GFP沒(méi)有細(xì)胞種類和位置上的限制，在各個(gè)部位都可以表達(dá)發(fā)出熒光。5、易于構(gòu)建載體：由于GFP分子量較小，僅為27-30kD，編碼GFP的基因序列也很短，所以很方便地同其它序列一起構(gòu)建多種質(zhì)粒。6、可進(jìn)行活細(xì)胞定時(shí)定位觀察。于得到突變體。第3頁(yè)/共8頁(yè)關(guān)于EGFP蛋白pEGFP-N3質(zhì)粒編碼EGFP蛋白，它是野生型綠色熒光蛋白（wtGFP）經(jīng)克隆技術(shù)改造而成的遺傳突變體。它有兩個(gè)氨基酸的替換，即Phe264→Leu和Ser265→Thr。用485nm光激發(fā)時(shí)，EGFP可以產(chǎn)生比wtGFP強(qiáng)35倍的熒光。另外，EGFP具有紅外轉(zhuǎn)換激發(fā)光譜（red-shiftedexcitationspectra），而且能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)得到高水平表達(dá)。第4頁(yè)/共8頁(yè)質(zhì)粒pEGFP-N3圖譜第5頁(yè)/共8頁(yè)表達(dá)載體pET-28apET表達(dá)體系是在大腸桿菌中克隆和表達(dá)融合蛋白常用的體系之一。使用T7Lac啟動(dòng)子；BamHI下游存在轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)；含有寡聚組氨酸鏈（His-tag),便于融合蛋白的純化。第6頁(yè)/