高效液相色譜結(jié)果分析第二講

高效液相色譜結(jié)果分析第二講第一頁，共二十七頁，2022年，8月28日一、色譜數(shù)據(jù)處理二、色譜圖三、色譜圖名詞術(shù)語四、色譜峰檢測五、HPLC測定步驟與內(nèi)容第二頁，共二十七頁，2022年，8月28日一.色譜數(shù)據(jù)處理檢測器記錄儀積分儀色譜工作站色譜儀信號輸出圖色譜數(shù)據(jù)處理是通過ADC轉(zhuǎn)換器,把模擬信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號,然后采用色譜軟件處理給出色譜圖等信息。數(shù)據(jù)處理原理自動處理人工修正

峰的檢測數(shù)據(jù)采集基線校正和重疊峰的分離

數(shù)據(jù)處理方法第三頁，共二十七頁，2022年，8月28日色譜柱流出物通過檢測器時所產(chǎn)生的響應(yīng)信號對時間的曲線圖,其縱坐標(biāo)為信號強度,橫坐標(biāo)為時間二.色譜圖(Chromatogram)樣品組分分離示意圖第四頁，共二十七頁，2022年，8月28日三.色譜圖名詞術(shù)語(1)色譜峰(Peak):色譜柱流出組分通過檢測器時產(chǎn)生的響應(yīng)信號.峰底(PeakBase):峰的起點與終點之間連接的直線.峰高(PeakHeight):峰最大值到峰底的距離.←色譜峰時間(分)峰高峰底響應(yīng)值(mV)基線↓第五頁，共二十七頁，2022年，8月28日切線峰寬(PeakWidth,峰寬):在峰兩側(cè)拐點處所作切線與峰底相交兩點之間的距離.半峰寬(PeakWidthatHalfHeight):通過峰高的中點作平行于峰底的直線，此直線與峰兩側(cè)相交兩點之間的距離

.峰面積(PeakArea):峰與峰底之間的面積,又稱響應(yīng)值.三.色譜圖名詞術(shù)語(2)色譜峰的判斷(最小面積)響應(yīng)值時間峰面積切線半峰寬切線峰寬第六頁，共二十七頁，2022年，8月28日三.液相色譜圖名詞術(shù)語(3)保留時間(TR)(Retentiontime):組分從進樣到出峰最大值所需的時間.死時間(t0)(Deadtime):不被固定相滯留組分的出峰時間.（其測定測定通常是使用不被柱子保留而又有紫外吸收的惰性物質(zhì)，例如：正相色譜常用四氯化碳，反相色譜常用甲醇、尿嘧啶、NaNO3等）.調(diào)整保留時間：tR’＝tR－t0第七頁，共二十七頁，2022年，8月28日保留體積(VR)(Retentionvolume):組分從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動相體積.死體積(V0)(Deadvolume):不被固定相滯留的組分,從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動相體積.調(diào)整保留體積：VR’＝VR－V0＝tR’?FC

Fc:流動相的流速mL/min.三.液相色譜圖名詞術(shù)語(4)第八頁，共二十七頁，2022年，8月28日譜帶擴展(BandBroadening):由于縱向擴散,傳質(zhì)阻力等因素的影響,使組分在色譜柱內(nèi)移動過程中譜帶寬度增加的現(xiàn)象.

三.液相色譜圖名詞術(shù)語(5)第九頁，共二十七頁，2022年，8月28日三.液相色譜圖名詞術(shù)語(6)拖尾峰(TailingPeak):

后沿較前沿平緩的不對稱峰.前伸峰(LeadingPeak):

前沿較后沿平緩的不對稱峰.鬼峰(GhostPeak):并非由試樣所產(chǎn)生的峰,亦稱假峰.第十頁，共二十七頁，2022年，8月28日Excellentt=1.0-1.05Acceptablet=1.2Unacceptablet=2Awfult=4正常前伸第十一頁，共二十七頁，2022年，8月28日三.液相色譜圖名詞術(shù)語(7)基線(Baseline):

在正常操作條件下,僅由流動相所產(chǎn)生的響應(yīng)信號.基線噪聲(BaselineNoise):

由各種因素所引起的基線波動.基線飄移(BaselineDrift):

基線隨時間定向的緩慢變化.基線基線噪音第十二頁，共二十七頁，2022年，8月28日基線飄移第十三頁，共二十七頁，2022年，8月28日峰寬半峰寬標(biāo)準(zhǔn)偏差σ標(biāo)準(zhǔn)偏差(σ)(Standarddeviation):0.607倍峰高處峰寬的一半，為便于測量，改用半峰寬。目的是為了計算柱效率(柱效)。柱效（理論塔板數(shù)）：或三.液相色譜圖名詞術(shù)語(8)進樣第十四頁，共二十七頁，2022年，8月28日圖示中塔板數(shù)為3.

塔板理論類似蒸餾中的氣液平衡第十五頁，共二十七頁，2022年，8月28日峰的檢測和判別是依據(jù)在基線的訊號水平上，預(yù)設(shè)一個“閾值”，超過該值時，判別為峰可開始檢測。一般采用下面兩種方式判別峰訊號的變化：依照信號斜率的變化檢測信號依照積分面積檢測峰信號四.色譜峰檢測切線

色譜峰的判斷最小面積第十六頁，共二十七頁，2022年，8月28日五.HPLC測定步驟與內(nèi)容1.確定色譜條件:

色譜柱的選擇，流動相、流速、檢測波長、柱溫及進樣量Ｓ等。2.繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線3.精密度試驗與回收率試驗4.實際樣品含量測定第十七頁，共二十七頁，2022年，8月28日1.確定色譜條件

色譜柱的選擇流動相流速檢測波長柱溫進樣量第十八頁，共二十七頁，2022年，8月28日2.繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線是定量分析的根本依據(jù).藥物濃度（或質(zhì)量）與藥物在檢測器上的產(chǎn)生的信號（通常采用峰面積A）成比例(正比).標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍確定取決于樣品最低濃度與最高濃度.標(biāo)準(zhǔn)曲線線性一般采用5-9點，并非點越多越好!第十九頁，共二十七頁，2022年，8月28日準(zhǔn)確度指用該方法測定的結(jié)果與真實值或參考值接近的程度，用百分回收率表示。相對回收率直接反映測定結(jié)果與真實值的接近程度,應(yīng)控制在100%左右(95%～105%)。絕對回收率模擬生物樣品經(jīng)整個樣品處理過程,而相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液直接分析,兩者的響應(yīng)值之比稱為絕對回收率。絕對回收率一般應(yīng)大于70%,過低說明方法中待測物質(zhì)損失嚴重。測定回收率R（recovery）的具體方法可采用“回收試驗法”和“加樣回收試驗法”。3.準(zhǔn)確度(accuracy)第二十頁，共二十七頁，2022年，8月28日(1)回收試驗空白+已知量A的對照品（或標(biāo)準(zhǔn)品）測定，測定值為M回收率100%-=AMR空白X(2)加樣回收試驗已準(zhǔn)確測定藥物含量P的真實樣品+已知量A的對照品（或標(biāo)準(zhǔn)品）測定，測定值為M100%X=APMR數(shù)據(jù)要求在規(guī)定的范圍內(nèi)，至少用9次測定結(jié)果評價，如高、中、低三個不同濃度樣品各測三次.回收率第二十一頁，共二十七頁，2022年，8月28日4.精密度(precision)精密度是指在規(guī)定條件下，同一個均勻樣品，經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度,表示測定的重現(xiàn)性。用偏差（d）、標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)(變異系數(shù)，CV)表示.(1)偏差(d）：測量值與平均值之差(2)標(biāo)準(zhǔn)(偏)差(SD或S）(3)相對標(biāo)準(zhǔn)(偏)差（RSD），也稱變異系數(shù)(CV,有日內(nèi)變異與日間變異兩種)第二十二頁，共二十七頁，2022年，8月28日5.檢測限(limitofdetection,LOD)指在確定的實驗條件下，HPLC能檢測出待測物的最低濃度或含量。(是限度檢驗效能指標(biāo)，無需定量測定，只要指出高于或低于該規(guī)定濃度即可).(1)信噪比法把已知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，算出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。一般以信噪比（S/N）3∶1或2∶1時的相應(yīng)濃度或量確定檢測限。(2)非儀器分析目視法用已知濃度的被測物，試驗出能被可靠地檢測出的最低濃度或量.第二十三頁，共二十七頁，2022年，8月28日指樣品中被測物能被定量測定的最低量，結(jié)果應(yīng)具有一定準(zhǔn)確度和精密度要求。6.定量限(1imitofquantitation，LOQ)(1)信噪比法確定定量限，一般以信噪比（S/N）為10∶1時相應(yīng)的濃度或注入儀器的量進行確定.(2)按1984年國際純粹和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(IVPAC)規(guī)定：用儀器所測空白背景響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)差（SD）的10倍為估計值，再經(jīng)試驗確定方法的實際測定下限.第二十四頁，共二十七頁，2022年，8月28日7.專屬性(specificity,或稱選擇性）指有其他成分（雜質(zhì)、降解物、輔料等）可能存在的情況下，采用的方法能準(zhǔn)確測定出被測物的特性，能反映該方法在有共存物時對供試物準(zhǔn)確而專屬的測定能力，是用于復(fù)雜樣品分析時是否受到相互干擾程度的度量.8.線性（Linearity）在設(shè)計范圍內(nèi)，測試結(jié)果與試樣中被測物濃度呈正比關(guān)系的程度。線形通常用最小二乘法處理數(shù)據(jù)求得回歸曲線的斜率（Slope）來表示。數(shù)據(jù)要求：至少需要五個濃度考察線形，需提供相關(guān)系數(shù)、y截距（檢定的可能偏差）、回歸斜率及方差等參數(shù)，應(yīng)列出回歸方程數(shù)和線性圖。第二十五頁，共二十七頁，2022年，8月28日指達到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性的條件下，測試方法適用的高、低限濃度或量的區(qū)間。范圍的確定可因測定項目不同而有不同要求：9.范圍（Range）

含量測定范圍為80%-120%；含量均勻度范圍為70%-130%；雜質(zhì)測定應(yīng)為被測雜質(zhì)限度的50%-120%；溶出度應(yīng)