基因工程原理重組基因?qū)胧荏w細胞

（優(yōu)選）基因工程原理重組基因?qū)胧荏w細胞當前第1頁\共有95頁\編于星期三\2點DNA重組（限制性內(nèi)切酶）運輸工具——基因克隆載體目的基因的制備目的基因?qū)胧荏w細胞外源基因的表達基因工程的應(yīng)用當前第2頁\共有95頁\編于星期三\2點第五章重組基因?qū)胧荏w細胞當前第3頁\共有95頁\編于星期三\2點第一節(jié)受體細胞受體細胞（receptorcell），又稱宿主細胞或寄主細胞，是能夠攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細胞。受體細胞的選擇應(yīng)符合以下原則：①便于重組DNA分子的導入②能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細胞中③便于重組體的篩選④遺傳穩(wěn)定性高⑤安全性高⑥內(nèi)源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低⑦遺傳密碼無明顯偏倚性⑧具有較好的轉(zhuǎn)移后加工機制當前第4頁\共有95頁\編于星期三\2點1.原核受體細胞較為理想的受體細胞：大部分沒有細胞壁，便于外源DNA進入沒有核膜，染色體DNA沒有固定結(jié)合的蛋白質(zhì)基因組簡單，不含線粒體、質(zhì)體多為單細胞，容易獲得一致性材料，易于擴大培養(yǎng)或發(fā)酵生長常用細菌：大腸桿菌。當前第5頁\共有95頁\編于星期三\2點大腸桿菌。特點：G-,單個細胞，0.5μm*(1~3)μm，周身鞭毛、能運動、無芽孢。例：胰島素、生長素、干擾素、RE……優(yōu)點：完善成熟的受體系統(tǒng)。缺點：毒素等，折疊加工問題當前第6頁\共有95頁\編于星期三\2點酵母菌表達系統(tǒng)的優(yōu)勢：結(jié)構(gòu)最為簡單的真核生物之一，基因表達調(diào)控機理比較清楚，遺傳操作簡單培養(yǎng)簡單遺傳穩(wěn)定性高，易于擴大培養(yǎng)或發(fā)酵生長安全性高，無致病性，不會對外界環(huán)境造成污染具有較好的轉(zhuǎn)譯后加工機制，便于真核生物表達2.酵母受體細胞當前第7頁\共有95頁\編于星期三\2點3.植物受體細胞優(yōu)點：真核細胞、細胞的全能性。4.動物細胞受體細胞包括：小鼠BHK細胞、中國倉鼠卵巢細胞CHO，猴腎細胞等受體動物：鼠、牛、羊、魚等當前第8頁\共有95頁\編于星期三\2點第二節(jié)重組基因?qū)胧荏w細胞一、重組基因?qū)朐耸荏w細胞接受DNA片段當前第9頁\共有95頁\編于星期三\2點轉(zhuǎn)化（transformation）——重組質(zhì)粒DNA分子進入受體細胞，并在受體細胞穩(wěn)定維持和表達的過程，轉(zhuǎn)化后的受體菌，稱轉(zhuǎn)化子。（一）轉(zhuǎn)化1928年英國學者F·Griffth在肺炎雙球菌中發(fā)現(xiàn)的，證明了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA。轉(zhuǎn)化率＝轉(zhuǎn)化子DNA分子數(shù)轉(zhuǎn)化子細胞數(shù)＝當前第10頁\共有95頁\編于星期三\2點Ca2+誘導大腸桿菌轉(zhuǎn)化法對數(shù)生長后期的菌體5x107個/毫升冰浴10分鐘含CaCl2緩沖液15分鐘含CaCl2緩沖液（1）感受態(tài)的制備（2）DNA分子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞（3）篩選轉(zhuǎn)化子。Ca2+：低溫下使磷質(zhì)層形成液晶結(jié)構(gòu)，使膜間核酸酶分離與DNA結(jié)合，抗DNase當前第11頁\共有95頁\編于星期三\2點（二）轉(zhuǎn)導是指通過λ噬菌體（病毒）顆粒感染宿主細胞將外源DNA分子導入到受體細胞內(nèi)并穩(wěn)定遺傳的過程。當前第12頁\共有95頁\編于星期三\2點D突變E突變?nèi)茉淳囵B(yǎng)誘導溶菌生長45℃15min39℃2-3h收集包裝物λ噬菌體DNA噬菌體顆粒轉(zhuǎn)導包裝當前第13頁\共有95頁\編于星期三\2點（三）轉(zhuǎn)染是采用與質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化受體細胞相似的方法，將重組λ噬菌體DNA分子直接導入受體細胞中的過程。當前第14頁\共有95頁\編于星期三\2點（四）電激穿孔是利用高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細胞膜上進行電穿孔，形成可逆的瞬間通道，從而促進外源DNA的有效吸收?！?988年，DowerWJ等參數(shù)：電場強度電脈沖時間外源DNA濃度當50%～70%菌體細胞死亡時，轉(zhuǎn)化率最高當前第15頁\共有95頁\編于星期三\2點（五）三親本雜交（triparentalmating）三親本雜交結(jié)合轉(zhuǎn)化法是基于非接合型質(zhì)粒的遷移作用而建立的一種DNA轉(zhuǎn)化方法。當前第16頁\共有95頁\編于星期三\2點當前第17頁\共有95頁\編于星期三\2點二、重組基因?qū)胫参锸荏w細胞（一）土壤農(nóng)桿菌介導的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化外植體：植物組織培養(yǎng)中作為離體培養(yǎng)材料的器官或組織的片段。在繼代培養(yǎng)時，將培養(yǎng)的組織切段移入新的培養(yǎng)基時，這種切段也稱外植體。將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實現(xiàn)外源基因向植物細胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過細胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。當前第18頁\共有95頁\編于星期三\2點（Vir區(qū)）（Con區(qū)）長度25kb，占Ti質(zhì)粒1/10主要功能是轉(zhuǎn)移DNA，隨機插入植物染色體中。——天然的質(zhì)?？寺≥d體。含有2類基因：（1）編碼冠癭堿合成酶（ocs、nos）及分解代謝的基因。（2）誘發(fā)腫瘤基因（Onc）Vir區(qū)：激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性。占Ti質(zhì)粒1/3。Con區(qū)——調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移，含有與細菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因tra。Ori區(qū)——復制起始區(qū)。當前第19頁\共有95頁\編于星期三\2點限制性酶切開外源基因Ti質(zhì)粒載體當前第20頁\共有95頁\編于星期三\2點（1）葉盤法轉(zhuǎn)化植物細胞當前第21頁\共有95頁\編于星期三\2點（2）整體植株接種轉(zhuǎn)化法人為地在整體植株上造成創(chuàng)傷部位，然后把農(nóng)桿菌接種在創(chuàng)傷表面，使農(nóng)桿菌按照天然的感染過程在植株體內(nèi)進行侵染。獲得轉(zhuǎn)化的植物愈傷組織或轉(zhuǎn)基因植株。當前第22頁\共有95頁\編于星期三\2點（3）原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法是以原生質(zhì)體作為受體細胞，通過將根癌農(nóng)桿菌與原生質(zhì)體作短暫的共培養(yǎng)，然后洗滌除去殘留的根癌農(nóng)桿菌后，置于含抗生素的選擇培養(yǎng)基上篩選出轉(zhuǎn)化細胞，進而再生成植株。當前第23頁\共有95頁\編于星期三\2點（4）懸浮細胞共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法與原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法相似當前第24頁\共有95頁\編于星期三\2點（二）植物病毒介導基因轉(zhuǎn)移植物病毒DNA病毒20%RNA病毒80%花椰菜花葉病毒：雙鏈DNA病毒當前第25頁\共有95頁\編于星期三\2點（三）化學誘導DNA直接轉(zhuǎn)化（1）多聚物介導法聚乙二醇多聚賴氨酸多聚鳥苷酸當前第26頁\共有95頁\編于星期三\2點（2）脂質(zhì)體介導基因轉(zhuǎn)化脂質(zhì)體當前第27頁\共有95頁\編于星期三\2點當前第28頁\共有95頁\編于星期三\2點（四）物理方法介導DNA直接轉(zhuǎn)化（1）基因槍轉(zhuǎn)化當前第29頁\共有95頁\編于星期三\2點（2）超聲波介導轉(zhuǎn)化（3）激光微束穿孔轉(zhuǎn)化當前第30頁\共有95頁\編于星期三\2點（4）顯微注射當前第31頁\共有95頁\編于星期三\2點當前第32頁\共有95頁\編于星期三\2點三、重組基因?qū)雱游锸荏w細胞（一）轉(zhuǎn)染法當前第33頁\共有95頁\編于星期三\2點（二）脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)化當前第34頁\共有95頁\編于星期三\2點（三）動物病毒介導轉(zhuǎn)導法當前第35頁\共有95頁\編于星期三\2點第三節(jié)重組子篩選只有少數(shù)受體細胞能被導入重組DNA分子例：大腸桿菌108個大腸桿菌，轉(zhuǎn)化效率10-6只有100個細胞被轉(zhuǎn)化當前第36頁\共有95頁\編于星期三\2點克隆子的篩選：經(jīng)過各種方法將外源DNA分子導入受體細胞后，獲得所需陽性克隆子的過程稱為克隆子的篩選（Screening）或選擇(Selection)。轉(zhuǎn)化子：導入外源DNA分子后能穩(wěn)定存在的受體細胞。重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子。如果重組子含有外源目的基因，又稱為陽性克隆子或期望重組子。當前第37頁\共有95頁\編于星期三\2點一、遺傳表型直接篩選（一）利用載體選擇性標記篩選轉(zhuǎn)化子抗藥性標插入失活篩選插入表達篩選α－互補法（藍白斑篩選法）（二）利用報告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細胞（三）利用遺傳選擇標記篩選哺乳動物轉(zhuǎn)基因細胞（四）營養(yǎng)缺陷型檢測法（五）形成噬菌斑篩選法當前第38頁\共有95頁\編于星期三\2點二、依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析篩選三、核酸雜交分析（一）分子探針：放射性探針、非放射性探針、標記探針的方法（二）核酸探針雜交分析四、免疫化學分析檢測（一）抗體檢測法（二）免疫沉淀測定法（Immunoprecipitation,IP）（三）轉(zhuǎn)譯篩選法五、PCR篩選法當前第39頁\共有95頁\編于星期三\2點一、遺傳表型直接篩選（一）利用載體選擇性標記篩選轉(zhuǎn)化子1.抗藥性標記氨芐青霉素氯霉素卡那霉素四環(huán)素鏈霉素當前第40頁\共有95頁\編于星期三\2點2.插入失活篩選當前第41頁\共有95頁\編于星期三\2點3.插入表達篩選載體的選擇性標記基因前鏈接一段附調(diào)控序列，插入式禍福調(diào)控序列后，其下游的篩選標記基因才能表達當前第42頁\共有95頁\編于星期三\2點。IPTG：異丙基-β-D-硫代半乳糖苷4.α－互補法（藍白斑篩選法）乳糖操縱子：當前第43頁\共有95頁\編于星期三\2點當前第44頁\共有95頁\編于星期三\2點IPTGα-互補：是指lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酶陰性的突變體之間實現(xiàn)互補。當前第45頁\共有95頁\編于星期三\2點IPTG：異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷顯色劑：X-gal，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，在β-半乳糖苷酶的催化下會產(chǎn)生藍色產(chǎn)物。當前第46頁\共有95頁\編于星期三\2點當前第47頁\共有95頁\編于星期三\2點（二）利用報告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細胞（1）新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（NPTⅡ）基因（2）潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPT）基因（3）氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶（CAT）基因（4）β—葡萄糖苷酶（GUS）基因（5）熒光素酶（LUC）基因（6）抗除草劑bar基因：抗草丁膦（7）冠癭堿合成酶基因報告基因(reportergene)——是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是一個其表達產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進行表達，從而利用它的表達產(chǎn)物來標定目的基因的表達調(diào)控，篩選得到轉(zhuǎn)化體。當前第48頁\共有95頁\編于星期三\2點熒光素酶（LUC）基因轉(zhuǎn)入了螢火蟲的熒光素酶基因能發(fā)光的煙草(1)螢光素+ATP→螢光素化腺苷酸（luciferyladenylate）+PPi(2)螢光素化腺苷酸+O2→氧螢光素+AMP+光機理：當前第49頁\共有95頁\編于星期三\2點GFP：綠色熒光蛋白日本科學家下村修（伍茲霍爾海洋生物學研究所）美國科學家馬丁?查爾菲（哥倫比亞大學）錢永?。永Ｄ醽喆髮W圣迭戈分校）2008年諾貝爾化學獎：當前第50頁\共有95頁\編于星期三\2點GFP標記的微管將綠黃紅熒光蛋白質(zhì)植入魚的DNA分子結(jié)構(gòu)中穩(wěn)定表達表達GFP的CHO細胞GFP轉(zhuǎn)基因小鼠當前第51頁\共有95頁\編于星期三\2點（三）利用遺傳選擇標記篩選哺乳動物轉(zhuǎn)基因細胞（1）胸苷激酶（TK）基因：（2）二氫葉酸還原酶（DHFR）基因（3）黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（XGPRT）基因：胸苷（T）轉(zhuǎn)換成TMP的基因催化二氫葉酸還原成四氫葉酸催化GMP生成當前第52頁\共有95頁\編于星期三\2點（四）營養(yǎng)缺陷型檢測法當前第53頁\共有95頁\編于星期三\2點（五）形成噬菌斑篩選法當前第54頁\共有95頁\編于星期三\2點二、依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析篩選（一）快速裂解菌落鑒定分子大?。涵傊请娪?，分析DNA分子大小（二）限制性核酸內(nèi)切酶酶解分析：DNA酶切圖譜（三）核酸雜交分析當前第55頁\共有95頁\編于星期三\2點三、核酸雜交分析基本原理：具有一定互補的兩條核酸(DNA或RNA)單鏈在適宜的溫度及離子強度等條件下，可按堿基互補配對原則高度特異地復性形成雙鏈。核酸雜交：兩種不同來源單鏈DNA或RNA相互配對的過程。分子雜交：生物大分子之間通過相互作用結(jié)合在一起：核酸之間通過堿基互補配對；蛋白質(zhì)之間通過抗原、抗體反應(yīng)；核酸、蛋白質(zhì)之間通過疏水作用，氫鍵進行相互作用?！?968年華盛頓卡內(nèi)基學院RoyBritten等當前第56頁\共有95頁\編于星期三\2點常見的分子雜交：Southernblotting：DNA，DNA/RNA

Northernblotting：RNA，DNA/RNA

Dot/slotblotting（斑點/狹縫雜交）insituhybridization：組織原位雜交Westernblotting：蛋白質(zhì)/抗原、抗體待測分子探針當前第57頁\共有95頁\編于星期三\2點（一）分子探針(Molecularprobe)：是指具有同特異性目標分子產(chǎn)生很強的相互作用并可對其相互作用的產(chǎn)物進行有效檢測的DNA分子、RNA分子和蛋白質(zhì)。1.放射性探針：32P、3H、35S、14C、125I當前第58頁\共有95頁\編于星期三\2點2.非放射性探針（1）生物素（biotin）標記探針：生物素與dUTP中尿嘧啶的5位C相連，在聚合酶作用參入DNAdUTPBiotin(維生素H，VH)連接臂當前第59頁\共有95頁\編于星期三\2點（藻紅素）（鏈霉親和素）（生物素）當前第60頁\共有95頁\編于星期三\2點（2）

地高辛標記探針：地高辛與UTP中尿嘧啶的C5相連dUTP連接臂地高辛地高辛：異羥基洋地黃毒苷，強心素，拉諾辛，Cardiox，Cardoxin，Cedoxin當前第61頁\共有95頁\編于星期三\2點當前第62頁\共有95頁\編于星期三\2點當前第63頁\共有95頁\編于星期三\2點（3）

熒光素標記探針：用熒光素標記核酸、抗生物素蛋白或抗地高辛抗體。

熒光物質(zhì)異硫氰酸熒光素（黃綠色）羅丹明（紅色）羥基香豆素（蘭色）當前第64頁\共有95頁\編于星期三\2點3.標記探針的方法（1）切口平移標記法當前第65頁\共有95頁\編于星期三\2點（2）隨機引物標記法當前第66頁\共有95頁\編于星期三\2點（3）末端標記法當前第67頁\共有95頁\編于星期三\2點（4）PCR標記法當前第68頁\共有95頁\編于星期三\2點（5）光敏標記法：光敏基團當前第69頁\共有95頁\編于星期三\2點（6）化學衍生結(jié)合標記法：（7）交叉相連標記法：當前第70頁\共有95頁\編于星期三\2點對重組體克隆進行篩選和鑒定的方法之一是利用核酸雜交法進行篩選，它包括Southern印記雜交法、Northern印記雜交、斑點印記雜交和（菌落原位雜交）雜交。各種雜交中需要對探針進行標記，其中對探針進行非放射性標記的常見標記物有（熒光素）、（生物素）、（地高辛）。標記探針的方法（切口平移標記法）、（隨機引物標記法）、（末端標記法）、（PCR標記法）、（光敏標記法）、化學衍生結(jié)合標記法以及交叉相連標記法。在利用lacZ失活的顯色反應(yīng)篩選法中，IPTG的作用是(a)(a)誘導宿主的α肽的合成(b)誘導宿主的ω肽的合成(c)作為酶的作用底物(d)作為顯色反應(yīng)的指示劑當前第71頁\共有95頁\編于星期三\2點α-互補篩選屬于下列哪種篩選方法：(B)A.抗藥性標志選擇B.標志補救C.原位雜交法D.酶聯(lián)免疫吸附E.分子雜交應(yīng)用α-互補篩選重組體時，含有外源基因的重組體菌落顏色應(yīng)為：(C)A.紫色B.藍色C.白色（阻遏蛋白不能表達）D.無色E.以上都不是水母發(fā)光蛋白由236個氨基酸構(gòu)成，其中Asp、Gly、Ser構(gòu)成發(fā)光環(huán)，現(xiàn)已將這種蛋白質(zhì)的基因作為生物轉(zhuǎn)基因的標記，在轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，這種蛋白質(zhì)的作用是（篩選標記）(C)A.促使目的基因?qū)胨拗骷毎蠦.促使目的基因在宿主細胞中復制C.使目的基因容易被檢測出來D.使目的基因容易成功表達建立了一個基因文庫后，如何鑒定一個攜帶目的基因的克隆?當前第72頁\共有95頁\編于星期三\2點（二）核酸探針雜交分析基本原理：具有一定同源性的兩條核酸（DNA或RNA）單鏈在適宜的溫度及離子強度等條件下，可按堿基互補配對原則高度特異地退火形成雙鏈。探針：用于檢測的核苷酸片段。Southernblotting：DNA/DNA,RNA

Northernblotting：RNA/DNA,RNA

Dotblotting：DNA芯片insituhybridization：組織原位雜交Westernblotting：蛋白質(zhì)/抗原、抗體當前第73頁\共有95頁\編于星期三\2點當前第74頁\共有95頁\編于星期三\2點（1）Southern印跡雜交

1975年由英國人southern創(chuàng)建待測的核酸序列：DNA探針：DNA或RNA當前第75頁\共有95頁\編于星期三\2點電轉(zhuǎn)移方法：濕式電轉(zhuǎn)移半干式電轉(zhuǎn)移當前第76頁\共有95頁\編于星期三\2點（2）Nouthern印跡雜交（1979年，J.C.Alwine等）待測的核酸序列：RNA探針：DNA或RNA當前第77頁\共有95頁\編于星期三\2點（3）斑點印跡雜交和狹線印跡雜交待測的核酸序列：DNA和RNA探針：DNA或RNA當前第78頁\共有95頁\編于星期三\2點（4）菌落（噬菌斑）原位雜交

Grunstein和Hosness，1975年當前第79頁\共有95頁\編于星期三\2點當前第80頁\共有95頁\編于星期三\2點（5）熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH）用特定熒光素如生物素、地高辛等標記探針，與靶DNA進行雜交，通過免疫細胞化學過程連接上熒光素標記物，在熒光顯微鏡下觀察探針標記或位點的技術(shù)。實驗流程：FISH樣本的制備→探針的制備→探針標記→雜交→（染色體顯帶）→熒光顯微鏡檢測→結(jié)果分析。當前第81頁\共有95頁\編于星期三\2點

組織原位雜交（Tissueinsituhybridization）簡稱原位雜交，指組織或細胞的原位雜交。是經(jīng)適當處理后，使細胞通透性增加，讓探針進入細胞內(nèi)與DNA或RNA雜交，因此原位雜交可以確定探針互補序列在胞內(nèi)的空間位置。（6）組織細胞的原位雜交當前第82頁\共有95頁\編于星期三\2點（7）影響探針雜交的因素探針分子與目標分子之間序列的同一性探針的長度：<500b探針濃度雜交加速劑：硫酸葡聚糖雜交漂洗液的組成、反應(yīng)溫度、鹽濃度當前第83頁\共有95頁\編于星期三\2點四、免疫化學分析檢測待測物：蛋白質(zhì)探針：抗原、抗體抗體測定法免疫沉淀法分類當前第84頁\共有95頁\編于星期三\2點（一）抗體檢測法放射性抗體測定法非放射性抗體測定法分類當前第85頁\共有95頁\編于星期三\2點1.放射性抗體測定Broome和Gilbert,1978年當前第86頁\共有95頁\編于星期三\2點2.非放射性抗體測定當前第87頁\共有95頁\編于星期三\2點當前第88頁\共有95頁\編于星期三\2點（二）免疫沉淀測定法（Immunoprecipitation,IP）是一種研究蛋白質(zhì)間交互作用的生物技術(shù)，這種技