兔實驗性蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管超微結(jié)構(gòu)的病理特征與動態(tài)變化

兔實驗性蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管超微結(jié)構(gòu)的病理特征與動態(tài)變化【摘要】目的探討蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后腦血管的超微結(jié)構(gòu)特征與動態(tài)變化，以及這種改變在遲發(fā)性腦血管痙攣(CVS)中的作用機制。方法對日本大耳白家兔采用枕大池二次注血法制做SAH模型。動物隨機分為SAH組、鹽水對照組、穿刺對照組和正常組，于注血后1h、第3天、第5天、第7天、第10天灌注固定，留取基底動脈標本，在光鏡和電鏡下動態(tài)觀察基底動脈的病理和超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果光鏡下SAH模型組的主要表現(xiàn)是血管壁增厚，管腔狹窄，內(nèi)皮細胞變性、腫脹，染色質(zhì)不均，空泡形成；內(nèi)彈力膜迂曲皺褶或斷裂。電鏡下超微結(jié)構(gòu)的主要表現(xiàn)是基底動脈內(nèi)皮細胞間緊密連接消失，胞膜部分或完全脫落，胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹、嵴紊亂、溶解呈空泡，致密顆粒增多，細胞核內(nèi)染色質(zhì)邊集、濃縮，異染色質(zhì)增多；平滑肌細胞變形、核扭曲、染色質(zhì)不均勻，肌絲排列疏松紊亂，出現(xiàn)斷裂或溶解，胞漿內(nèi)可見大量空泡形成，線粒體增多、腫脹、嵴紊亂或溶解；血管外膜神經(jīng)纖維腫脹、結(jié)構(gòu)模糊。光鏡下基底動脈的結(jié)構(gòu)變化趨勢與電鏡下基底動脈的結(jié)構(gòu)變化趨勢相類似，均在SAH后1h時可發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)的微小改變，從第3天開始明顯的結(jié)構(gòu)改變，在第5天至第7天結(jié)構(gòu)變化最明顯。結(jié)論SAH后腦血管的超微結(jié)構(gòu)會發(fā)生損害，并在病程發(fā)展中呈明顯的動態(tài)改變；血管內(nèi)皮細胞的損害是導致遲發(fā)性CVS的重要因素之一。

【關(guān)鍵詞】蛛網(wǎng)膜下腔出血；病理改變；超微結(jié)構(gòu)；遲發(fā)性腦血管痙攣

Theultrastructuralpathologicalcharacteristicsanddynamicchangesofbrainvesselaftersubarachnoidhemorrhageinexperimentalrabbits

ABSTRACT:ObjectiveTodiscusstheultrastructuralpathologicalcharacteristicsanddynamicchangesofbrainvesselaftersubarachnoidhemorrhage(SAH),andthemechanismofthesechangesindelayedcerebralvasospasm.MethodsSAHmodelwasmadebyinfusingbloodtwiceintothecisternmagnaofJapaneserabbits.TheanimalsweredividedrandomlyintoSAHgroup,salinegroup,puncturegroupandblankgroup,at1h,3d,5d,7dand10dafterthefirstinfusiontheanimalswereperfusedandbasilararterywasharvested.Ultrastructuralchangeswereobservedunderlightmicroscopeandelectronmicroscope.ResultsUnderthelightmicroscope,thevesselwallbecamethick,thevesselcavitybecamenarrow,theendotheliacellsbecameswollen,vacuolescouldbefoundinthechromatin,innerelasticmembranebecamereductusandbroke.Undertheelectronmicroscope,thecloseconnectionbetweentheendothelialcellsdisappeared,themembraneofthecellsfelloff,andthemitochondriabecameswollen,vacuolescouldbeseen,thechromatinbecameconcentrated,heterochromatincouldbeseen,smoothmusclebecamedeformed,chromatinbecameuneven,myofilamenthadderangementandfragmentationanddissolved,vacuoluscouldbeseeninthekytoplasm,mitochondrionbecameswollen.Thestructuralchangeofbasilararteryunderthelightmicroscopegotsimilartothatundertheelectronmicroscope;slightchangewasobservedrightafter1hofSAH,significantchangewasobservedat3d,andmostobviouschangewasobservedbetween5dand7d.ConclusionUltrastructuralchangeswereobservedinthebasilararteryafterSAH,andsignificantdynamicchangeswereobservedintheprogress.Thedamageofendotheliacellsmaybetheimportantfactorswhichcausedelayedcerebralvasospasm.

KEYWORDS:subarachnoidhemorrhage;pathologicalchange;ultrastructure;delayedcerebralvasospasm

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoidhemorrhage,SAH)后最重要的病理變化之一就是遲發(fā)性腦血管痙攣(cerebralvasospasm,CVS)。它是導致延遲性缺血性神經(jīng)功能障礙最主要的致病因素之一。但是，由于缺乏明確的病因?qū)W資料，在臨床上診斷和治療遲發(fā)性CVS均比較棘手。雖然國內(nèi)外許多學者針對其發(fā)病機制進行了大量的臨床和基礎(chǔ)研究[14]，但對遲發(fā)性CVS的病理過程及病理機制仍然缺乏深入的認識。本實驗采用枕大池二次注血法建立兔SAH后CVS模型，動態(tài)觀察了遲發(fā)性CVS后基底動脈超微結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律。旨在進一步探討SAH后遲發(fā)性CVS的發(fā)生機制。

1材料與方法

材料實驗動物為日本大耳白家兔，45只，雌雄不拘，健康狀況良好，體重(±)kg，在相同的條件及環(huán)境中(飼料和溫度均相同)飼養(yǎng)一周后進行實驗。所有實驗用兔均購自西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心。

實驗試劑及藥品：40g/L多聚甲醛灌注液購自西安交通大學醫(yī)學院器材科；250g/L烏拉坦溶液、/L枸櫞酸鹽緩沖液，即PBS緩沖液以及修復液均由西安交通大學醫(yī)學院組織胚胎與解剖實驗室提供；自制PBS配制的/L戊二醛固定液；利多卡因注射液及手術(shù)器械由西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科提供。

實驗分組動物隨機分組：SAH模型組20只，鹽水對照組15只，穿刺對照組5只，空白對照組5只。SAH模型組根據(jù)建立模型后的不同時間段分為5個亞組，分別是：建模后的1h、3d、5d、7d、10d組。每個亞組4只動物。鹽水對照組亦根據(jù)建模后不同時間段分為5個亞組，分別是：建模后的1h、3d、5d、7d、10d。每個亞組3只動物。穿刺對照組和空白對照組分別取5只做腦血管超微結(jié)構(gòu)研究。

動物模型的建立白兔于枕部剃毛，消毒后于枕部中線作一直切口，長約，銳性分離直達寰枕筋膜，充分顯露寰枕部，用18G套管針與軀體成角約30°穿刺枕大池，方向指向右眼外眥，當穿破環(huán)枕筋膜時有突破感，停止進針，退出針芯，此時可見清亮腦脊液流出。取兔耳中央動脈的非抗凝血/kg，以/s的速度緩慢注入枕大池內(nèi)。退出套管針，局部壓迫后，縫合切口，取側(cè)臥頭低30度位放置30min，使血液聚集在腦基底池。首次注血后48h，由兔耳中央動脈取血1mL/kg，按上述方法，再次注入枕大池內(nèi)。

標本采取所有大耳白家兔飼養(yǎng)到對應(yīng)時間后，用250g/L烏拉坦以3mL/kg麻醉，打開胸腔，剝開心包膜，暴露心臟，將下腔靜脈和腹主動脈然后用動脈夾夾閉，剪開右心耳放出血液，再剪開左心室將灌注頭插入主動脈然后用動脈夾固定，先輸入9g/L生理鹽水將血管內(nèi)的血沖洗干凈，再注入40g/L的多聚甲醛固定液2000mL灌流固定。在處理電鏡組織標本的時候，用相同方法將生理鹽水灌注干凈后，再用/L的戊二醛固定液1000mL灌注固定后，將基底動脈固定于電鏡固定液中，待制作電鏡標本。

透射電鏡標本：將基底動脈標本用電鏡固定液固定，采用常規(guī)電鏡標本制作方法，經(jīng)清洗、脫水、浸透、包埋和修塊后作超薄切片，在透射電鏡下觀察。

掃描電鏡標本：將基底動脈血管于固定前在顯微鏡下縱向剖開，同法將基底動脈標本用電鏡固定液固定，按常規(guī)掃描電鏡樣品制作方法制備后在掃描電鏡下觀察。

2結(jié)果

SAH的大體觀察實驗動物在造模后的不同時間經(jīng)多聚甲醛灌注取腦，其中SAH模型組在1h可見廣泛的SAH，全腦未見明顯的凝血塊，3d、5d、7d可見枕大池、基底池附近及基底動脈周圍明顯的凝血塊，隨時間的推移，凝血塊的范圍、大小和顏色呈現(xiàn)減退，至第10天，枕大池、基底池及基底動脈周圍凝血塊已經(jīng)基本消失，但仍可見少量SAH。

基底動脈血管內(nèi)皮的HE染色的光鏡結(jié)構(gòu)變化穿刺對照組、鹽水對照組的血管結(jié)構(gòu)與正常組一樣，血管壁無增厚，內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)彈力膜清晰可見，結(jié)構(gòu)完整；中膜主要是平滑肌細胞及其周圍的細胞外基質(zhì)；外膜主要由成纖維細胞和疏松的結(jié)締組織構(gòu)成。SAH模型組可見血管壁增厚，管腔狹窄，內(nèi)皮細胞變性、腫脹，染色質(zhì)不均，空泡形成；內(nèi)彈力膜迂曲皺褶或斷裂，厚薄不均；中膜增厚，平滑肌細胞排列紊亂；外膜可見淋巴細胞或單核細胞浸潤。

透射電鏡下的基底動脈超微結(jié)構(gòu)的變化電鏡下正常血管壁超微結(jié)構(gòu)可見內(nèi)皮細胞間緊密連接，呈紡錘形，其內(nèi)含有少量的吞飲小泡，線粒體結(jié)構(gòu)正常。彈力層排列整齊，肌絲排列規(guī)則(圖1A)。SAH實驗組中，1h開始就可觀察到有內(nèi)皮細胞間連接變寬，有空泡形成，平滑肌細胞腫脹(圖1B)；3d開始可見明顯內(nèi)皮結(jié)構(gòu)改變(圖1C-圖1E)，至7d最嚴重(圖1F)，隨后開始慢慢恢復(圖1G)。超微結(jié)構(gòu)變化主要可見內(nèi)皮細胞間緊密連接消失，胞膜不完整，部分或完全脫落，胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹、嵴紊亂、溶解，致密顆粒增多；胞質(zhì)可見較多的電子致密顆粒，高爾基體部分囊化，胞質(zhì)呈溶解狀；細胞核內(nèi)染色質(zhì)邊集、濃縮，異染色質(zhì)增多；內(nèi)彈力膜明顯皺褶、裸露、厚薄不均；膠原纖維向內(nèi)皮層生長，彈力層明顯扭曲呈波紋狀，平滑肌細胞變性、核扭曲、染色質(zhì)不均勻，肌微絲排列疏松紊亂，出現(xiàn)斷裂或溶解，可見片狀高電子密度物質(zhì)，胞漿密度不均，內(nèi)可見大片溶解區(qū)、溶酶體樣致密小體及線粒體增多，增多的線粒體大多腫脹、嵴紊亂或溶解；血管外膜神經(jīng)纖維腫脹、結(jié)構(gòu)模糊，偶見炎性細胞浸潤。而鹽水對照組和穿刺對照組的超微結(jié)構(gòu)沒有明顯的改變，基本與正常組相同。

掃描電鏡下的基底動脈血管的超微結(jié)構(gòu)的變化正常組血管內(nèi)皮光滑，無異常改變。SAH實驗組血管內(nèi)皮腫脹、邊界不清、排列紊亂，可見內(nèi)皮細胞碎裂和間斷缺損，有纖維蛋白凝塊沉積，血栓附著(圖1H)。

圖1透射電鏡下的正?；讋用}結(jié)構(gòu)與SAH模型組的基底動脈超微結(jié)構(gòu)的變化(A-G)，以及掃描電鏡下的SAH模型組血管內(nèi)皮細胞的變化(H)

ThenormalbasilararterystructureandthechangesofbasilararteryultramicrostructureinSAHgroupundertransmissionelectronmicroscope(A-G),andthechangesofvascularendothelialcellsunderscanningelectronmicroscope(H)

A:normalvascularstructure(endothelium,smoothmuscleandtunicaadventitia,×2000);B:theabnormalendothelialcellcelljunctionin1hafterinjectingblood,andtherewasvacuolization(×30000);C:smoothmusclecellularswellingin1hafterinjectingblood(×10000);D:theelasticitymembranewasbrokenin3dafterinjectingblood,andsmoothmusclecellsgrewtowardbreakageplace(×10000);E:theendothelialcellswereamoticin5dafterinjectingblood(×3500);F:theendothelialcellsnuclearswelling,theappearanceandthicknesswereasymmetricalinelasticitytunicainterna(×3500);G:theendothelialcells,elasticitymembraneandsmoothmusclein10dafterinjectingblood(×3500);H:underscanningmicroscopeitcouldbeseenthatthebasilararteryvascularendotheliumbecameswollen,hadobscureboundaryandarrangementinchaoson7thdayofSAHgroup;andendotheliocytesbrokeinpiecesandhaddiscontinuousdefect,andtherecouldbeseenfibrinclotdeposition,andthrombuscohering(×2000)

3討論

SAH后腦血管是否有病理性變化及其變化特點，眾多學者說法不一，Tanabe等認為SAH后痙攣的腦血管可出現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)的改變，Smith等認為腦血管的病理性改變是造成遲發(fā)性CVS的原因，而Clower在其實驗中卻未發(fā)現(xiàn)有血管壁的超微結(jié)構(gòu)的改變。雖然，關(guān)于遲發(fā)性CVS的發(fā)病機制及其病理基礎(chǔ)也存在較大爭議,但是，在大量SAH患者尸檢和實驗性SAH動物模型研究中均發(fā)現(xiàn)痙攣的血管內(nèi)皮細胞存在明顯的病理改變，大量研究均認為血管內(nèi)皮細胞損害在CVS的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。但是，目前對SAH后血管內(nèi)皮細胞的損傷機制尚不十分明確。在體內(nèi)研究中，內(nèi)皮細胞的損害一方面可能由蛛網(wǎng)膜下腔積血及分解產(chǎn)物所引起的毒性所致。另一方面,痙攣的血管持續(xù)強烈地收縮也可繼發(fā)內(nèi)皮細胞的機械性損傷，兩者作用難以區(qū)分。

本實驗通過枕大池二次注血法建立兔SAH后CVS的模型，動態(tài)觀察了兔SAH后基底動脈血管的大體形態(tài)、光鏡結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)的變化。在大體形態(tài)中觀察到廣泛的SAH和枕大池、基底池附近的凝血塊，印證了CVS發(fā)生的首要條件是血管長時間浸泡在SAH的積血中[10]，導致其收縮舒張平衡[11]的自我調(diào)節(jié)機制紊亂，管壁順應(yīng)性和舒張功能下降與收縮功能增強。在光鏡和電鏡結(jié)構(gòu)變化中觀察到，隨著注血后時間的推移，光鏡下基底動脈的結(jié)構(gòu)變化趨勢與電鏡下基底動脈的結(jié)構(gòu)變化趨勢相類似，均在1h時可發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)的微小改變，從第3天開始出現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)改變，在第5天至第7天達到結(jié)構(gòu)變化最明顯和病變最嚴重的時間。這與趙振偉等[12]研究結(jié)果相同。

Omoo等[13]研究認為SAH后痙攣血管的病理改變首先是內(nèi)皮細胞的損傷，而正常內(nèi)皮功能的實現(xiàn)是依靠內(nèi)皮細胞的完整性。Findlay等[14]在猴SAH模型中觀察到血管內(nèi)皮細胞出現(xiàn)明顯的超微病理損害，如細胞變性、破壞溶解、細胞間隙增寬和細胞間緊密連接斷裂等，并可導致內(nèi)皮細胞脫落。我們在實驗中也觀察到，在光鏡下內(nèi)皮細胞變形、腫脹，染色質(zhì)不均，在電鏡下內(nèi)皮細胞間緊密連接消失，胞膜不完整，部分或完全脫落，胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹、嵴紊亂、破壞溶解，致密顆粒增多；血管內(nèi)皮細胞間緊密連接的破壞消失可減弱血管內(nèi)皮細胞的屏障作用。內(nèi)皮細胞的這些變化直接影響到血管的正常功能，引起細胞轉(zhuǎn)導途徑等的一系列的改變。內(nèi)皮細胞機能障礙可使內(nèi)皮素1在血管內(nèi)皮的含量增加，而降鈣素基因相關(guān)肽的含量減少，引起血管的收縮舒張物質(zhì)平衡被打破，可能是引起血管痙攣的直接原因。同時在實驗中還觀察到，光鏡下內(nèi)彈力膜迂曲皺褶或斷裂，厚薄不均，電鏡下內(nèi)彈力膜明顯皺褶、裸露、厚薄不均，膠原纖維向內(nèi)皮層生長，彈力層明顯扭曲呈波紋狀，平滑肌細胞變形、核扭曲、染色質(zhì)不均勻，肌絲排列疏松紊亂。彈力膜與平滑肌細胞的這些改變可以引起血管壁的不規(guī)則增厚，間接的導致了管腔的縮窄。彈力膜的結(jié)構(gòu)變化表現(xiàn)在大體結(jié)構(gòu)中就是血管的縮窄性改變，但并不意味著發(fā)生血管縮窄性改變就一定會有CVS和遲發(fā)性神經(jīng)功能障礙的發(fā)生。它的意義是僅僅提供了CVS發(fā)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

Park等[15]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)生CVS的血管壁中可見免疫球蛋白IgG及補體C3的沉積，由此推論在CVS的發(fā)生中炎癥反應(yīng)可能是機制之一。亦有研究證明：血漿與腦脊液中內(nèi)皮素1水平升高可以引起CVS[16]。線粒體是細胞進行生物氧化、供能和儲能的主要結(jié)構(gòu)，其數(shù)目多少與細胞種類及功能狀態(tài)有關(guān)。在正常情況下血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞內(nèi)的線粒體較少，而當細胞受內(nèi)外因素作用影響時，線粒體出現(xiàn)反應(yīng)最早，變化也最明顯。從SAH模型組中可以觀察到線粒體大多腫脹、嵴紊亂或空化，以第5天到第7天組最為明顯，線粒體功能明顯異常。這可能與遲發(fā)性CVS所導致的神經(jīng)功能障礙有關(guān)。我們在電鏡觀察中發(fā)現(xiàn)，基底動脈在1h時僅有內(nèi)皮細胞間連接變寬，胞質(zhì)破壞溶解，平滑肌細胞可見腫脹?？傮w來看，由于受到血管收縮舒張調(diào)節(jié)機制紊亂以及CVS、炎癥反應(yīng)等的影響，進而線粒體膜通透性改變，導致線粒體腫脹、嵴紊亂或破壞溶解，促使細胞代償性增加或直接生成線粒體增加。而上述因素的存在又使得增加的線粒體不能發(fā)揮正常的功能，導致細胞缺氧、功能障礙。這些因素長時間的存在使得超微結(jié)構(gòu)功能缺失不斷加重，同時可能引起降鈣素基因相關(guān)肽減少，內(nèi)皮素1增加，影響正常內(nèi)皮細胞的功能，打破了血管的收縮舒張平衡，導致CVS的發(fā)生[17]。從實驗可以看出CVS在第5天左右達到最高峰，也就是細胞功能缺損最嚴重的時間段；而其在發(fā)病初期表現(xiàn)的并不顯著。

本實驗結(jié)果表明：①SAH后CVS的發(fā)生與腦血管的病理改變密切相關(guān)；②SAH后腦血管超微結(jié)構(gòu)的主要改變是內(nèi)皮細胞緊密連接消失、髓鞘溶解、線粒體腫脹、嵴紊亂或破壞溶解；平滑肌層扭曲、斷裂；③SAH后血性腦脊液可直接造成明顯的血管內(nèi)皮細胞病理形態(tài)學損害,并對血管內(nèi)皮細胞代謝和增殖具有明顯的抑制作用。這種內(nèi)皮細胞的損害使得腦血管腔發(fā)生縮窄性改變，導致CVS的發(fā)生。提示減輕SAH后內(nèi)皮細胞的損害、促進內(nèi)皮細胞代謝可能是CVS治療策略中的重要環(huán)節(jié)。

【參考文獻】

[1]NazliJ,MayerS.Cerebralvasospasmaftersubaracnoidhemorrhage[J].CurrOpinCritCare,2003,9(2):113119.

HickeyJ,BuckleyD.Cerebralaneurysms[M]//HickJ,ed.Theclinicalpracticeofneurologicalandnerosurgicaled.Philadelphia:LippincoWilliams&Wilkins,2003:523548.

LochRM,MarcusS,BryceW.Intracranialaneurysms[J].NeurosurgQuart,2001,11(3):181198.

葉偉,蔣傳路,李永立，等.兔腦基底動脈痙攣的實驗研究[J].中華神經(jīng)外科雜志,2001,17(3)178180.

TanabeY,SakataK,YamadaH,etal.Cerebralvasospasmandultrastructuralchangesincerebralarterialwall[J].JNeurosurg,1987,49(3):229234.

SmithR,ClowerR,PeelerV,etal.Theangiopathyofsubarachnoidhemorrhage:angiographicandmorphologiccorrelates[J].Stroke,1983,14(3):240246.

ClowerBR,KappJ,MooreNA,etal.lntracisternalbloodinjectionsfailtoproducedcerebralangiopathyincats[J].ExperimNeurol,1986,94(3):292299.

ZubkovAY,TibbsRE,ClowerB,etal.Morphologicalchangesofcerebralarteriesinacaninedoublehemorrhagemodel[J].NeurosciLett,2002,326(2):137141.

ParkKW,MetaisC,DaiHB,etal.Microvascularendothelialdysfunctionanditsmechanisminaratmodelofsubarachnoidhemorrhage[J].AnesthAnalg,2001,92(4):990998.

[10]ZubkovAY,OgiharaK,TumuP,etal.Bloodycerebrospinalfluidaterscontractilityofculturedarteries[J].NeurolRes,1999,21(6):553558.

[11]I