魚和肉的鮮三甲胺和組胺結(jié)構(gòu)分析

魚和肉的鮮三甲胺和組胺結(jié)構(gòu)分析氧化三甲胺

氧化三甲胺分子式為(CH3)3NO,(TrimethylamineN-oxide,TMAO)其化學(xué)結(jié)構(gòu)與甲基供體膽堿、甜菜堿和S-腺苷甲硫氨酸等相似。

氧化三甲胺廣泛分布于海水動物產(chǎn)品肌肉中,具有特殊的鮮味。一般海水硬骨魚含100-1000mg/100g,海水軟骨魚中含700-1400mg/100g，淡水魚中含量很少，一般在10mg/100g。氧化三甲胺廣泛分布于海產(chǎn)硬骨魚類的肌肉中,但在體內(nèi)的分布并不均勻。鰭、肌肉肌節(jié)的頭部和尾部含量特別高。在黑肉色的魚中,紅肌中氧化三甲胺含量比白肌中高;而在白肉色魚中情況卻相反。氧化三甲胺的生理功能氧化三甲胺作為動物體內(nèi)重要的無毒中間代謝物,氧化三甲胺是一種蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑和有機滲透劑,參與海生硬骨魚和某些廣鹽性硬骨魚等的滲透調(diào)節(jié),在水產(chǎn)業(yè)中具有廣闊應(yīng)用前景。三甲胺的產(chǎn)生1.氧化三甲胺是魚鮮美味道的主要來源,氧化三甲胺極不穩(wěn)定,魚死后，在腐敗細菌尤其是兼性厭氧菌（如互生單孢菌、腐敗極毛菌）的作用下,很容易還原成三甲胺。氧化三甲胺是一種鮮味物質(zhì)含量與鮮度密切相關(guān)。2.魚類的紅肌中含有內(nèi)源性的氧化三甲胺還原酶。Fe2+

在氧化三甲胺轉(zhuǎn)變?yōu)槿装泛投装?DMA)中起重要的作用。在Fe2+

、血紅蛋白和半胱氨酸存在下，4℃氧化三甲胺轉(zhuǎn)變?yōu)槿装泛投装贰?/p>

2Cys＋2Fe3＋→Cys－Cys＋2Fe2＋＋2H＋

Me3NO＋2H＋＋

2Fe2＋→Me3N＋2Fe3＋＋H2O3.氧化三甲胺一經(jīng)加熱就會分解，罐頭及其它海水魚加工中常有此反應(yīng)。Me3NO→Me3N＋HCHO4.水產(chǎn)動物中的卵磷脂經(jīng)微生物分解產(chǎn)生三甲胺，但量較少。－CH2OP－OCH2CH2－N（CH3）3三甲胺含量－鮮度指標(biāo)隨著魚的新鮮程度的不斷降低,魚體內(nèi)的三甲胺不斷增加,魚的腥味也不斷變濃。鑒于此,可以把三甲胺的測定值作為魚類腐敗情況的一個重要質(zhì)量控制參數(shù)三甲胺有氧化三甲胺生成。最初1936年Beatty建議用三甲胺作鮮度指標(biāo)。國內(nèi)郭大釣等人以馬面鲀?yōu)樵希沧C實了這一結(jié)果指標(biāo)：TMA4-6mg%新鮮，6-10mg%不新鮮，TMA20-30mg%腐敗。

三甲胺-氮的測定苦味酸比色法GB/T5009.179-2003中華人民共和國火腿衛(wèi)生國家標(biāo)準(zhǔn)

苦味酸比色法

一、原理：將三甲胺抽提于無水甲苯中，與苦辣酸作用，形成黃色的苦味酸三甲胺鹽，于410nm下有最大吸收。然后與標(biāo)準(zhǔn)管同進比色，即可測得檢樣中三甲胺氮含量。

苦味酸三甲胺性質(zhì):易溶于甲苯溶液中,以分子狀態(tài)存在。在水溶液中以離子狀態(tài)存在410nm加入甲醛的目的：消除氨的干擾6HCHO＋4NH3→(CH2)6N4+6H2O二、試劑

1、

20%三氯乙酸溶液。2、甲苯：試劑級，用無水硫酸鈉脫水，再用1N硫酸振搖、蒸餾，除干擾物質(zhì)，最后再用無水硫酸鈉脫水使其干燥。3、苦味酸甲苯溶液：

儲備液：將2g干燥的苦味酸（試劑級）溶于100mL無水甲苯中，使其成為2%苦味酸甲苯溶液。

應(yīng)用液：將儲備液稀釋成為0.02%苦味酸甲苯溶液即可用。4、

1:1碳酸鉀溶液。

5

、10%甲醛溶液：先將甲醛用碳酸鎂振搖處理并過濾，然后稀釋成為10%濃度。

苦味酸比色法三、儀器25mLMaijelGerson反應(yīng)瓶。721型光電比色計。

苦味酸比色法四、操作方法1、檢樣外理：取被檢肉樣20g（視檢樣新鮮程度確定取樣量）剪細研勻，加水70mL，提取后過濾。加20%三氯乙酸10mL，振搖，沉淀蛋白后過濾，濾液即可供測定用。2、呈色反應(yīng)：萃?。喝V液5mL于反應(yīng)瓶中，加10%甲醛溶液1mL，甲苯10mL及1：1碳酸鉀溶液3mL，立即蓋上塞，上下劇烈振搖60次，靜置20min。吸去下面水層，加入無水硫酸鈉約進行脫水?？辔端岜壬ū壬磻?yīng)：吸出5mL甲苯萃取液于預(yù)先已置有0.02%苦味酸甲苯溶液5mL的試管中，輕輕搖動，混合均勻，在410nm處或用藍色濾光片測得吸光度，并做一空白試驗?？辔端岜壬?.標(biāo)準(zhǔn)曲線：配置鹽酸三甲胺（試劑級）約為％，用微量或半微量凱氏蒸餾法準(zhǔn)確測定三甲胺-氮量。再稀釋成10ug/mL的三甲胺-氮，作為儲備液用。準(zhǔn)備吸取后稀釋標(biāo)準(zhǔn)液、、、、（相當(dāng)于10ug、20ug、30ug、40ug、50ug）于25mLMaijelGerson反應(yīng)瓶中，加蒸餾水中至，按上法同樣測定，確定三甲胺-N與光密度制備標(biāo)準(zhǔn)曲線?？辔端岜壬?/p>

樣品實驗標(biāo)準(zhǔn)曲線（10ug/mL的三甲胺－氮）mL

提取

濾液5mL01.02.03.04.05.0水5.04.03..02.01.0010%甲醛溶液1mL甲苯10mL1：1碳酸鉀溶液3mL蓋上塞，上下劇烈振搖60次，靜置吸去下面水層，加入無水硫酸鈉約0.5g進行脫水。

呈色反應(yīng)取5mL甲苯提取溶液＋5mL苦味酸甲苯溶液(0.02%)

比色410nm比色五、計算：

C——相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)的三甲胺-氮質(zhì)量，μg;

W——檢樣質(zhì)量，g;

V1——檢樣后體積，mL

V2——稀釋后體積，mL。

氣敏電極法氣敏電極法三甲胺是魚和貝類腐敗時產(chǎn)生的一種氣體,其含量大小能直接反映魚和貝類的新鮮程度,1980年代末日本就開始研制用氣體傳感器測量三甲胺含量來判斷海魚和貝類新鮮程度的方法。八十年代,我國東海為尋求更簡單的測定方法，參考George等的實驗，采用國產(chǎn)的氣敏電極改裝成TMA特效電極（即TMA氣敏電極），試驗TMA和其他其它胺類的相應(yīng)情況，并且與苦味酸鹽比色法的回收率進行比較。一、原理氣敏電極是七十年代發(fā)展起來的離子交換電極，是將指示電極(離子選擇性電極)與參比電極裝入同一個套管中,做成一個復(fù)合電極，實際上是一個化學(xué)電池。該電極由最外層憎水性透氣膜,只允許使電極響應(yīng)的氣體擴散通過，而不允許溶液中的離子通過。內(nèi)充0.01TMA·HCl鹽和混合溶液。溶液中氣體擴散直至膜內(nèi)外兩邊分壓相同為止。試驗品中的氣體分壓與溶液濃度成正比。此時，TMA特效電極以奈斯特關(guān)系反應(yīng)TMA的濃度變化，這種變化可以通過測量此特效電極與內(nèi)參電極見得電勢差而獲得測試樣中濃度的定量值。氣敏電極法二、儀器和試劑PNH3氨氣敏電極;6511型電動恒溫攪拌器TMA·Cl標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.00×10-1mol/L)氣敏電極法三、試驗方法1、取10克魚肉加200mL水，用高速組織搗碎機搗碎，稱取50克魚肉漿，加37％甲醛攪拌均勻后，抽濾。2、取10克魚肉提取液在50mL容量瓶中，加37％甲醛0.25mL和，加水稀釋到刻度，振蕩均勻，在室溫下放置3分鐘。氣敏電極法測定前此液顛倒數(shù)次，倒入50mL燒杯中，磁力攪拌片刻，停止攪拌后當(dāng)液體不轉(zhuǎn)動時，讀取其毫伏值。當(dāng)電位在1min內(nèi)變化不超過1mV時,即認(rèn)為讀數(shù)已達到平衡(一般為2～5min)3、工作曲線的繪制

1.00×10-6～1.00×10-2mol/LTMA·HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液10mL,37％甲醛和同樣方法測定，繪制濃度與毫伏值的工作曲線。最低檢出限為5.00×10-6mol/L氣敏電極法銨離子的工作曲線氣敏電極法四、實驗中應(yīng)該注意的事項1、共存物質(zhì)苯、苯酚、甲苯、二甲基萘、吡啶、喹啉等均無干擾。而揮發(fā)性胺類(如乙胺)的存在有明顯的干擾。

Fe3+、Al3+、Cu2+

離子等在堿性溶液中生成沉淀,在低濃度的氨溶液中引起電位偏離。為消除其影響,加入EDTA溶液以消除其干擾。2、電極電位受溫度影響較大，在20～30℃范圍內(nèi)，dE/dT值在0.5mV左右,因此樣品測定溫度應(yīng)和工作曲線測定時的溫度盡可能相同，測定溫度不要低于15℃,否則會影響響應(yīng)時間氣敏電極法第三節(jié)組胺的檢測組胺的產(chǎn)生在青皮紅肉魚中（金槍魚、鮐魚、鳀魚），所含組氨酸在弱酸性條件下經(jīng)細菌的作用后（摩爾根變形桿菌、組胺無色菌），脫羧產(chǎn)生組胺。組胺是一種過敏性毒物，對組胺過敏的人，吃了一口含組胺的魚就可能引起反應(yīng)。中毒癥狀臉紅、頭暈、頭痛、口肉麻木、眼部充血、蕁麻疹、心跳加快，胸悶呼吸急促等。人體中毒約。發(fā)病時間快，一般在10分鐘到3小時內(nèi)，發(fā)病率較高（30％左右），但是癥狀較輕，恢復(fù)也較快，多在翌日可自行痊愈。標(biāo)準(zhǔn)：水產(chǎn)品組胺含量不超過52mg%組胺的檢驗重氮鹽比色法有色化合物480nm

呈色反應(yīng)一、原理

重氮鹽的形成：甲：對硝基苯胺，加濃鹽酸5mL，溶解后，加水至200mL，冰箱儲存。乙：亞硝酸鈉，加水溶解至100mL（現(xiàn)用現(xiàn)配）二、儀器與試劑

10%三氯乙酸:25%氫氧化鈉重氮鹽試劑：甲：對硝基苯胺克，加濃鹽酸5mL，溶解后，加水至200mL，冰箱儲存。乙：亞硝酸鈉克，加水溶解至100mL（現(xiàn)用現(xiàn)配）組胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液:準(zhǔn)確稱取在硫酸干燥器中干燥24h的磷酸組胺27.67mg(分析純)，用水溶解并定容至100mL容量瓶中。該溶液每毫升含組胺1mg。組胺標(biāo)準(zhǔn)使用液:準(zhǔn)確吸取組胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液于500mL容量瓶中，用水定容至刻度，該溶液每毫升含組胺為10ug。三、試驗方法1、樣品處理除去樣品中的非可食部分，將樣品搗碎、混勻，準(zhǔn)確稱取1-5g于50mL具塞三角瓶中中，加人20mL三氯醋酸(10%)，在60℃水浴中浸提30min，過濾。殘渣用水洗2次(每次加水10mL)并過濾，合并濾液。用氫氧化鈉溶液(250g/L)中和濾液至，再用水定容至100mL.2.抽提：正戊醇抽提：取濾液1mL于分液漏斗中，加入25％NaOH使其呈堿性。再加入3mL正戊醇，振搖分層提取，然后取正戊醇層。酸液提?。喝≌齑家?mL，至于另一個漏斗中，加入3mLHCl（1mol/L），混合均勻，靜止5分鐘，分層，取下層鹽酸溶液。重復(fù)提取3次，合并提取液。水層：堿液正戊醇層：組胺酸液層：組胺的鹽酸鹽正戊醇層3.呈色反應(yīng)：取鹽酸提取液于10ml比色管，加入3mLNa2CO3(5%)，偶氮試劑3mL，混勻，用水稀釋至10mL，混合后放置10分鐘，在480nm測光密度。4、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取組胺標(biāo)準(zhǔn)使用液0、、、、、，各加1mLHCl(1mol/L)、3mLNa2CO3(5%)、偶氮試劑3mL。同樣操作，測定吸光值。確定組胺濃度與吸光值的關(guān)系曲線。計算4.實驗準(zhǔn)確度：本法測定水產(chǎn)品中組胺含量，簡單、快速、易操作。日間與日內(nèi)精密度實驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.01%-2.90%?；厥章试?0%一110%之間，方法的重現(xiàn)性與準(zhǔn)確度好。第四節(jié)次黃嘌呤與K值魚類的肌肉運動必須依靠三磷酸腺苷(ATP)轉(zhuǎn)化提供能量，而魚體死后其體內(nèi)所含ATP按下列途徑分解:ATP→ADP(二磷酸腺苷)→AMP(磷酸腺苷)→IMP(肌苷酸)→HxR(肌苷)→Hx(次黃嘌呤)一、次黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶法以次黃嘌呤為指標(biāo)確定水產(chǎn)品的鮮度，黃魚100－200ppm為新鮮，鯧魚100－250ppm為新鮮，河鯽魚小于50ppm為新鮮。2,6一二氯靛酚次黃嘌呤pH7.6緩沖液黃嘌呤氧化酶尿酸波長600nm?A/?T（一）原理：（二）試驗試劑2,6一二氯靛酚溶液：用磷酸緩沖液配制成23ug/mL黃嘌呤氧化酶溶液：活力單位/mL黃嘌呤氧化酶法（三）試驗方法1.樣品處理：測定時取樣10g，用0.6mo1/L高氯酸40mL攪拌提取，過濾。取濾液25mL，用KOH調(diào)至，將高氯酸鉀沉淀過濾，然后用磷酸緩沖液（pH7.6）定容至50mL。黃嘌呤氧化酶法2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取次黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)液（40ug/mL），各至于1cm比色皿中，→加入磷酸緩沖液至總體積5.8mL→加2,6一二氯靛酚溶液lmL→最后加黃嘌呤氧化酶溶液0.2mL，立即混勻，于600nm波長下測定吸光度?！谧x數(shù)時在加酶后30秒后讀取2-3min即可，以最初的2-3min內(nèi)讀取的光密度計算反應(yīng)速度(?A/?T)→標(biāo)準(zhǔn)曲線：次黃嘌呤濃度－反應(yīng)速度?A/?T關(guān)系的。黃嘌呤氧化酶法3.樣品測定：加樣品液1mL于lcm比色杯中，加2,6一二氯靛酚溶液lmL，加磷酸緩沖液2mL，加次黃嘌呤氧化酶溶液0.2mL，立即混勻，于600nm波長下測定吸光度。以最初的2-3min內(nèi)讀取的光密度計算反應(yīng)速度(吸光度變化/min)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品中次黃嘌呤的含量。黃嘌呤氧化酶法二、K值魚類的肌肉運動必須依靠三磷酸腺苷(ATP)轉(zhuǎn)化提供能量，而魚體死后其體內(nèi)所含ATP按下列途徑分解:ATP→ADP(二磷酸腺苷)→AMP(一磷酸腺苷)→IMP(肌苷酸)→HxR(肌苷)→Hx(次黃嘌呤)K值是以核苷酸的分解產(chǎn)物作為指標(biāo)的鮮度判定方法K值與揮發(fā)性鹽基氮的區(qū)別重點因為動物一旦生命活動停止，因為核酸是合成蛋白質(zhì)的密碼，核酸比蛋白質(zhì)分解得早，所以ATP的降解早于蛋白質(zhì)的降解。ATP的降解作用就開始，伴隨著次黃嘌呤等降解產(chǎn)物的生成。此時蛋白質(zhì)還沒有開始分解。當(dāng)ATP的降解產(chǎn)物次黃嘌呤和黃嘌呤濃度很高時，揮發(fā)性鹽基氮還很低。K值是反映水產(chǎn)品鮮度的指標(biāo)。當(dāng)揮發(fā)性鹽基氮的含量較高時，水產(chǎn)品往往鮮度就比較差，因此揮發(fā)性鹽基氮的含量是表示水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的指標(biāo)。K值越小表明產(chǎn)品越新鮮。K值作為評價魚類新鮮度的化學(xué)指標(biāo)應(yīng)用較準(zhǔn)確，尤其適合對魚類早期鮮度的評定，許多學(xué)者建議將K值作為評定魚類鮮度的指標(biāo)。一般新鮮魚的K值為10以下。K值的測量方法有高效液相色譜法(HPLC)、極譜法、離子柱層析簡易測定法。目前認(rèn)為高效液相色譜法較好

（一）液相色譜的測定：1.高效液相色譜儀條件：色譜柱：ODSC18分離柱(octadecylsilyl十八烷基硅烷柱)流動相：2PO4－K2HPO4(pH6.6)，流速：1mL/min。檢測波長：254nm，靈敏度。進樣量：10uL。標(biāo)準(zhǔn)：以1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx進行高效液相色譜測定。得到標(biāo)準(zhǔn)核苷酸色譜分離譜圖。2.樣品處理：取魚肉粉碎，準(zhǔn)確稱取1g置于10mL離心試管中，加入冰冷的10%高氯酸2mL，用玻璃棒攪拌，離心，取上清液。用10mol/LKOH中和至pH為，沉淀部分離心除去，用冰水洗滌沉淀，最后用冷高氯酸定容至10mL。上液相分析，確定每一種核苷酸的含量3.計算：K值（％）=(HxR+Hx)/(ATP+ADP+AMP+IMP+HxR+Hx)×100（二）快速液相色譜據(jù)大島敏明等將鯉魚、鱒魚以快速的液相色譜測定K值。液相色譜條件液相柱：u-BondapakC18不銹鋼柱（waters,1″*1/4″內(nèi)徑）洗脫液：0.05mol/L(NH4)2HPO4–EtOH(95:5)，流速。紫外：250nm。標(biāo)準(zhǔn)：以1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx等體積混合，進行高效液相色譜測定。在－5min的保留時間內(nèi)，可以出現(xiàn)三個峰。第一個峰P1代表ATP、ADP、AMP及IMP的混合物的峰P2第二和三個峰分