蛋白質(zhì)電泳技術(shù)介紹

電泳技術(shù)介紹蛋白質(zhì)電泳技術(shù)介紹SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS(polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE)蛋白質(zhì)電泳技術(shù)介紹基本原理1.SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂。2.蛋白質(zhì)樣品在100℃用SDS和還原劑處理，可解聚成亞基,加入SDS，改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象。3.各種SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物均帶相同密度的負(fù)電荷，其荷電超過了原蛋白質(zhì)，消除了不同蛋白質(zhì)的荷電差異。蛋白質(zhì)電泳技術(shù)介紹圖解蛋白質(zhì)電泳技術(shù)介紹多孔凝膠混合大分子電泳蛋白質(zhì)電泳技術(shù)介紹操作流程制膠上樣電泳染色脫色蛋白質(zhì)電泳技術(shù)介紹制膠1將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干，把玻璃板在灌膠支架上固定好2按照配方制備分離膠，TEMED在灌膠前加入混勻，迅速灌膠3在分離膠上迅速并輕柔的加上水或無水乙醇進(jìn)行水封（凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面）4倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干,按比例配好濃縮膠,連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5mm處,迅速插入樣梳,靜置40分鐘具體步驟蛋白質(zhì)電泳技術(shù)介紹上樣按一定順序在加樣孔中加入樣品，根據(jù)SDS電泳玻璃板間隙厚度不同，選擇加入樣品量。電泳打開電源將電壓調(diào)到80v（一般15min左右），待樣品跑過壓縮膠后將電壓調(diào)到120v至樣品電泳到膠底部為止。蛋白質(zhì)電泳技術(shù)介紹染色將凝膠小心取下放入容器中，加入染色液（考馬斯亮藍(lán)），用搖床搖2－3h脫色待條帶清晰后倒出染色液，加入脫色液過夜。將脫色液倒掉，可以用QualityOne，或者相應(yīng)的成像系統(tǒng)拍照、分析、估算蛋白濃度。蛋白質(zhì)電泳技術(shù)介紹等電聚焦電泳

(IsoelectrofocusingIEForEF)蛋白質(zhì)電泳技術(shù)介紹等電聚焦電泳，是利用有pH梯度的介質(zhì)分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。由于其分辨率可到達(dá)0.01pH單位，因此特別適合于分離分子量相近而等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)組分。適用:1.研究蛋白質(zhì)微觀不均一性

2.測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)基本原理蛋白質(zhì)電泳技術(shù)介紹4形成電場(chǎng)3蛋白質(zhì)加樣21用電流在凝膠溶液中建立一個(gè)穩(wěn)定的PH梯度蛋白質(zhì)移動(dòng)到它們各自的等電點(diǎn)，不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)被分開蛋白質(zhì)電泳技術(shù)介紹

+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10蛋白質(zhì)電泳技術(shù)介紹pH梯度構(gòu)建載體兩性電解質(zhì)pH梯度(CarrierampholytespHgradients，CA):在電場(chǎng)中通過兩性緩沖離子建立的pH梯度。固相pH梯度（immobilizedpHgradients，IPG）將緩沖基團(tuán)共價(jià)鍵合在介質(zhì)上成為凝膠介質(zhì)的一部分而建立pH梯度（線性和非線性），分辨率比前者高一個(gè)數(shù)量級(jí)。蛋白質(zhì)電泳技術(shù)介紹載體兩性電解質(zhì)（CA）應(yīng)具備的條件(1)在等電點(diǎn)處必需有足夠的緩沖能力(2)在等電點(diǎn)必需有足夠高的電導(dǎo)(3)分子量要小，便于與被分離的高分子物質(zhì)用透析或凝膠過濾法分開。(4)化學(xué)組成應(yīng)不同于被分離物質(zhì)，不干擾測(cè)定。(5)應(yīng)不與分離物質(zhì)反應(yīng)或使之變性。蛋白質(zhì)電泳技術(shù)介紹操作流程1234制膠裝管裝槽，電泳剝膠5固定6測(cè)定pH梯度蛋白質(zhì)電泳技術(shù)介紹具體步驟1.配膠2.裝管每個(gè)學(xué)生裝兩支管，每組裝四支。先用肥皂洗手，然后將圓盤電泳槽的玻璃管洗凈，底端用塑料薄膜和橡皮筋封口，垂直放在試管架上，用移液管將配好的膠液移入管內(nèi)，（每根玻璃管的容量約為1.5-1.8ml）,液面加至距管口1mm處，用注射器輕輕加入少許H2O，進(jìn)行水封，以消除彎月面使膠柱頂端平坦。膠管垂直聚合約30分鐘，聚合完成時(shí)可觀察到水封下的折光面。蛋白質(zhì)電泳技術(shù)介紹3.裝槽和電泳用濾紙條吸去膠管上端的水封，除去下端的薄膜，水封端向上，將膠管垂直插入圓盤電泳槽內(nèi)，調(diào)節(jié)好各管的高度，記下管號(hào)。每支管約1/3在上槽，2/3在下槽。上槽加入500ml0.1MH3PO4，下槽加入500ml0.1MNaOH，淹沒各管口和電極，用注射器或滴管吸去管口的氣泡。上槽接正極，下槽接負(fù)極，開啟電泳儀，恒壓160V，聚焦2至3小時(shí)，至電流近于零不再降低時(shí)，停止電泳。蛋白質(zhì)電泳技術(shù)介紹4.剝膠取下膠管，用H2O將膠管和兩端洗2次，用注射器沿管壁輕輕插入針頭，在轉(zhuǎn)動(dòng)膠管和內(nèi)插針頭的同時(shí)分別向膠管兩端注入H2O少許，膠條即自行滑出，若不滑出可用洗耳球輕輕擠出。膠條置于小培養(yǎng)皿內(nèi)，記住正極端為“頭”，負(fù)極端為“尾”，若分不清時(shí)，可用pH試紙鑒定，酸性端為正，堿性端為負(fù)。蛋白質(zhì)電泳技術(shù)介紹5.固定取2支膠條置于一個(gè)小培養(yǎng)皿內(nèi)，倒入10%三氯乙酸溶液至沒過膠條，進(jìn)行固定，約半小時(shí)后，即可看到膠條內(nèi)蛋白質(zhì)的白色沉淀帶。固定完畢，倒出固定液，用直尺量出膠條長(zhǎng)度“L2”和正極端到蛋白質(zhì)白色沉淀帶中心（即聚焦部位）的長(zhǎng)度“L’”。固定后的膠條可在康強(qiáng)860紫外/可見分光光度計(jì)上用280nm或238nm波長(zhǎng)作凝膠掃描，然后用掃描圖作相應(yīng)的測(cè)量和計(jì)算。蛋白質(zhì)電泳技術(shù)介紹6.測(cè)定pH梯度將放在另一個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)未固定的膠條，用直尺量出待測(cè)pH膠條的長(zhǎng)度“L1”。按照由正極至負(fù)極的順序，用鑷子和小刀依次將膠條切成10mm長(zhǎng)的小段，分別置于小試管中，加入1mlH2O，浸泡半小時(shí)以上或過夜，用仔細(xì)校正后的帶細(xì)長(zhǎng)pH復(fù)合電極的pH計(jì)測(cè)出每管浸出液的pH值。蛋白質(zhì)電泳技術(shù)介紹優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：分辨率高，區(qū)帶清晰、窄，加樣部位自由，重現(xiàn)性好，不僅可測(cè)定蛋白或多肽的等電點(diǎn)而且能將不同等電點(diǎn)的混合生物大分子進(jìn)行分離和鑒定

。缺點(diǎn)：需無鹽溶液，不適用于在等電點(diǎn)不溶解或發(fā)生變性的蛋白。蛋白質(zhì)電泳技術(shù)介紹雙向電泳（2-Delectrophoresis）蛋白質(zhì)電泳技術(shù)介紹基本原理第一向進(jìn)行等電聚焦，蛋白質(zhì)沿pH梯度分離（將適宜的IPG試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合中緩沖基團(tuán)通過乙烯鍵共價(jià)聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度），至各自的等電點(diǎn)；隨后，再沿垂直的方向進(jìn)行分子量的分離。蛋白質(zhì)電泳技術(shù)介紹第一向：等電聚焦電泳第二向：SDS水平方向：反映出蛋白在pI上的差異垂直方向：反映出它們?cè)诜肿恿可系牟顒e圖解蛋白質(zhì)電泳技術(shù)介紹2D電泳操作流程細(xì)胞裂解勻漿預(yù)分級(jí)除雜質(zhì)濃縮定量樣品制備挖點(diǎn)酶解點(diǎn)靶蛋白鑒定分離雙向電泳第一向第二向染色銀染考染熒光圖譜分析圖像獲取圖譜分析蛋白質(zhì)電泳技術(shù)介紹1.樣品制備2.固相預(yù)制膠條的水化3.第一向等電聚焦3.1.取出IPG預(yù)制膠條（7cmpH4-7），室溫平衡。3.2.在聚焦盤或水化盤中加入樣品。3.3.去除預(yù)制IPG膠條上的保護(hù)層。具體步驟蛋白質(zhì)電泳技術(shù)介紹3.4.將IPG膠條置于聚焦盤或水化盤中。3.5.在每根膠條上覆蓋1ml礦物油。3.6.對(duì)好正、負(fù)極，蓋上蓋子。3.7.設(shè)置等電聚焦程序。4.膠條的平衡4.1冰箱中取出的膠條，于室溫放置10分鐘。蛋白質(zhì)電泳技術(shù)介紹4.2配制膠條平衡緩沖液I。4.3吸去膠條上的礦物油及多余的樣品。4.4第一次平衡。振蕩15分鐘。