3株木霉菌對人參銹腐病菌的拮抗作用

3株木霉菌對人參銹腐病菌的拮抗作用

人參的銹腐爛病是由真菌引起的。這是人參生產(chǎn)中最重要的疾病之一，嚴(yán)重影響了人參的質(zhì)量和產(chǎn)量。傳統(tǒng)上對人參銹腐病的防治一般采用化學(xué)防治,但由于大量化學(xué)農(nóng)藥施用使得人參不僅產(chǎn)量低、品質(zhì)差,而且農(nóng)藥殘留嚴(yán)重,直接影響其在國際市場上的競爭力。在國家GAP的要求下,研制藥效持久且對環(huán)境無壓力的微生物農(nóng)藥已成為藥用植物病害防治新的發(fā)展方向,藥用植物病害生防菌的篩選也就得到了廣泛關(guān)注。木霉菌作為一種有效的生防菌,廣泛存在于土壤中,具有生存能力強(qiáng)、適應(yīng)性廣、能夠拮抗多種病原真菌等優(yōu)點,越來越受到人們重視。本研究以人參銹腐病菌為靶標(biāo)菌,從79株木霉菌株中篩選出具有高抑菌活性的3株菌株,并就其對3種常用殺菌劑的耐藥性進(jìn)行測定,最終篩選出1株具有生防利用潛力的菌株ECT-01,為藥用植物病害生防菌的進(jìn)一步研究與利用奠定了基礎(chǔ)。1材料和方法1.1供試菌種及藥劑供試靶標(biāo)菌:人參銹腐菌(Cylindrocarpondestructan),由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病害流行實驗室保存。供試生防菌:79株木霉菌(Trichodermaspp.),分離自遼寧藥用植物種植基地根際土壤中。供試殺菌劑:50%多菌靈可濕性粉劑(江陰市農(nóng)藥二廠有限公司);95%惡霉靈原藥(北京北農(nóng)綠亨科技發(fā)展有限公司);75%百菌清可濕性粉劑[先正達(dá)(中國)投資有限公司]。1.2抗木霉菌和菌株的篩選1.2.1菌株單孢分離將79株木霉菌菌株活化后打取菌片(直徑為4mm),在PDA培養(yǎng)基上生長,3d后長勢較快的菌株進(jìn)行單孢分離,其余菌株予以淘汰。1.2.2人參銹腐菌種的接種采用對峙培養(yǎng)法,用打孔器自培養(yǎng)5d的供試木霉菌和人參銹腐菌菌落邊緣打取直徑4mm的菌塊,分別接種在平板上相對的兩側(cè),相距4cm,倒置,25℃恒溫培養(yǎng),以只接種人參銹腐菌為對照。每處理重復(fù)3次,每隔12h觀察1次,5d后按以下公式計算抑制率:抑制率=(對照半徑-處理半徑)/(對照半徑-菌碟半徑)×100%。1.3生長處理工藝中人參銹腐菌的生長參考高克祥等的方法,將木霉菌和人參銹腐菌相對接種在加有一薄層滅菌PDA培養(yǎng)基的無菌載玻片上放入培養(yǎng)皿中,25℃恒溫保濕培養(yǎng),待木霉菌菌絲和人參銹腐菌菌絲接觸后,取出載玻片,在光學(xué)顯微鏡下觀察對峙培養(yǎng)交界處的菌絲形態(tài)。1.4木霉菌對平板的生長采用生長速率法,經(jīng)預(yù)試驗后將不同藥劑分別按不同濃度與溶化的PDA培養(yǎng)基混勻制成含藥培養(yǎng)基平板,分別于平板中央接入直徑4mm的木霉菌菌片,25℃下培養(yǎng),以不加藥的PDA平板為對照。待對照菌絲長滿培養(yǎng)皿時調(diào)查菌落直徑、計算菌落生長抑制率,將抑制百分率換算成抑制幾率值,以濃度對數(shù)為橫坐標(biāo),抑制幾率值為縱坐標(biāo),作回歸直線,求出回歸方程及有效中濃度(EC50)。2結(jié)果與分析2.1生長速率及抑制率從藥用植物土壤中篩選出的79株木霉菌經(jīng)過初篩,獲得33株生長速率較快的木霉菌株,純培養(yǎng)時均可在96h內(nèi)長滿培養(yǎng)皿。利用對峙培養(yǎng)法進(jìn)行復(fù)篩,測定33株木霉菌對人參銹腐菌的抑制率。120h后對人參銹腐菌抑制率達(dá)到70%的有3株,70%～60%之間的有24株,低于60%的有6株。其中ECT-01、WWZ22-11和2-673株木霉菌生長速率較快,36h與人參銹腐菌菌落接觸,并能在60h內(nèi)迅速包圍人參銹腐菌菌落,在菌落上產(chǎn)生大量孢子,對人參銹腐菌菌落生長的抑制率分別是77.24%、76.08%、74.06%。根據(jù)以上結(jié)果,進(jìn)一步對ECT-01、WWZ22-11、2-673株木霉菌與人參銹腐菌的菌絲相互作用進(jìn)行觀察。2.2木霉菌對人參銹腐菌生長和產(chǎn)孢量的影響對峙培養(yǎng)中,可觀察到3株木霉菌與人參銹腐菌之間的相互作用。在接種后36h內(nèi),3株木霉菌均可與人參銹腐菌的菌絲發(fā)生明顯的接觸,隨后木霉菌或者覆蓋或者侵入人參銹腐菌菌落,抑制人參銹腐菌菌落生長,最終使其菌落逐漸萎縮,木霉菌菌絲布滿整個培養(yǎng)皿,占領(lǐng)全部的營養(yǎng)空間,并在人參銹腐菌菌落上產(chǎn)生孢子,但3株木霉菌中WWZ22-11產(chǎn)孢量較低。通過顯微觀察發(fā)現(xiàn),3株木霉菌菌絲對人參銹腐菌菌絲的作用方式不同(表1),如ECT-01與2-67對人參銹腐菌菌絲的作用方式較復(fù)雜(圖1),主要通過纏繞、侵入、穿透菌絲、吸附在菌絲上以及與人參銹腐菌菌絲平行生長,來吸取人參銹腐菌菌絲養(yǎng)分,最終使人參銹腐菌干枯解體,直至死亡。其中2-67能夠產(chǎn)生侵入釘侵入病原菌菌絲內(nèi)部吸收營養(yǎng)。WWZ22-11對人參銹腐病病原菌菌絲的作用方式較簡單,主要通過纏繞和平行生長的方式,寄生于人參銹腐菌菌絲上。2.3株木霉菌對百菌清的耐藥性殺菌劑對木霉菌的抑制作用隨藥劑施用濃度的增大而逐漸增強(qiáng)(表2),篩選出的3株拮抗木霉菌對多菌靈特別敏感,其中菌株WWZ22-11對多菌靈的耐藥性相對較強(qiáng),EC50為0.69mg/L;菌株ECT-01、2-67對多菌靈的耐藥性較弱,EC50分別為0.30mg/L、0.33mg/L。百菌清濃度在100mg/L以上,3株木霉菌均能生長,但菌絲生長受到抑制,表現(xiàn)為菌落邊緣致密,菌絲及菌落變形,3株木霉菌中ECT-01對百菌清的耐藥性最強(qiáng),EC50為2.8mg/L,WWZ22-11、2-67對百菌清的耐藥性均較弱,EC50分別為0.46mg/L、0.45mg/L(表3)。惡霉靈對3株木霉菌的抑制作用較小,在濃度達(dá)到600mg/L時,3株木霉菌仍能生長,其中ECT-01對惡霉靈的耐藥性較強(qiáng),EC50為174.51mg/L,菌株WWZ22-11和2-67的EC50分別為121.61mg/L、165.30mg/L,表明惡霉靈在正常施用濃度下,對3株木霉菌生長的抑制作用極其微弱(表4)。3株網(wǎng)絡(luò)霉菌對人參銹腐菌的抗性檢測木霉菌是廣泛存在于土壤和植物根系中的一類微生物,從20世紀(jì)30年代Weindling第一次發(fā)現(xiàn)木素木霉菌(Trichodermalignorum)可以寄生于多種植物病原真菌以來,一直被作為理想的生防菌而得到廣泛的重視。木霉屬的某些種用于防治尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌、整齊小核菌等病原菌引起的農(nóng)作物病害已有報道,但用于藥用植物病害防治的研究較少。本試驗以人參銹腐病病原菌為靶標(biāo)菌,利用生長速率法、平皿對峙法,從79株木霉菌株中篩選出3株拮抗效果較好的菌株ECT-01、WWZ22-11、2-67,3株木霉菌對人參銹腐菌抑制率分別達(dá)到77.24%、76.08%、74.06%。通過對其拮抗機(jī)理的初步研究發(fā)現(xiàn),在接種后36h內(nèi),3株木霉菌均可與人參銹腐菌的菌絲發(fā)生明顯的接觸,隨后木霉菌或者覆蓋或者侵入人參銹腐菌的菌落,抑制菌落生長,最終使人參銹腐菌菌落逐漸萎縮。通過顯微觀察進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)菌株ECT-01、2-67的菌絲對人參銹腐菌的作用方式較復(fù)雜,主要通過纏繞、平行生長、侵入、穿透等方式作用于人參銹腐菌菌絲上,同時發(fā)現(xiàn)菌株2-67存在侵入釘結(jié)構(gòu);菌株WWZ22-11的菌絲對人參銹腐菌的作用方式相對較簡單,只觀察到了纏繞和平行生長的現(xiàn)象,與高克祥等觀察到的木霉菌重寄生作用種類相符,但未發(fā)現(xiàn)附著孢或鉤狀分枝,說明木霉菌菌株ECT-01、2-67對人參銹腐菌菌絲的重寄生作用明顯高于WWZ22-11。近年來,高效殺菌劑的大面積高頻率施用,不僅使病原菌產(chǎn)生了抗藥性,還大量殘留在土壤中,嚴(yán)重威脅到有益微生物的生存。篩選出的3株人參銹腐病拮抗菌木霉菌