穗花杉組培快繁技術(shù)研究

穗花杉組培快繁技術(shù)研究

根據(jù)劉克旺和孫同興的研究，綏化山紅杉是第三系殘留植物，雌性和少雄性。果實(shí)量小，不穩(wěn)定，分為大、小、小的不同年份。種子期長(zhǎng)，幼苗容易干燥，整個(gè)植物死亡。高繁育效率低。根據(jù)嚴(yán)格的棲息地條件和嚴(yán)重的人為破壞，我們研究了綏化山的有效繁殖方法。如果我們能通過(guò)小規(guī)模的修剪來(lái)生長(zhǎng)綏化山，有效的快速栽培，對(duì)于保護(hù)珍稀穗花杉的群落非常重要。從1998年10月到2001年3月，將桿段作為室外植物進(jìn)行了無(wú)菌組織培訓(xùn)試驗(yàn)，并取得了初步成效。1材料和方法1.1材料表面從保護(hù)區(qū)移入苗圃的穗花杉實(shí)生苗,取莖段進(jìn)行組織培養(yǎng);當(dāng)年發(fā)芽苗,取嫩莖試驗(yàn).1.2方法1.2.1帶節(jié)莖段作外植體接種4月下旬～11月上旬,采集嫩枝,自來(lái)水及洗滌液處理過(guò)后,切分成約0.8～1cm的帶節(jié)莖段作外植體接種.因紅豆杉科植物組培污染和褐化是大問(wèn)題,試驗(yàn)采用了KMnO4、70%酒精、0.1%升汞3種藥品不同處理時(shí)間共9組合進(jìn)行正交試驗(yàn),對(duì)莖段進(jìn)行綜合消毒處理.每組20瓶培養(yǎng)基進(jìn)行比較試驗(yàn),培養(yǎng)30d后記載污染數(shù)、褐化數(shù)、存活數(shù).1.2.2水株或6-baba、kt、u3000添加不同濃度的激素基本培養(yǎng)基有1/2MS和MB共2種,添加蔗糖前者為2.5g/100g,后者為2.0g/100g,瓊脂0.8g/100g,pH值5.8,活性炭0.3g/100g,并附加不同濃度的激素,如NAA、6-BA(BA)、ZT、KT、IBA等.128℃高溫蒸氣滅菌15min.1.2.3誘導(dǎo)誘導(dǎo)試驗(yàn)培養(yǎng)基為1/2MS(基)+蔗糖2.5g/100g+瓊脂0.8g/100g+活性炭0.3g/100g+BA3mg/L+NAA2mg/L,依不同溫度(21、25℃)及光照(明、暗)情況分4組交叉試驗(yàn).30d后觀察愈傷組織誘導(dǎo)情況,50d后觀察腋芽誘導(dǎo)情況.1.2.4激素配比對(duì)高校說(shuō)利用中南林學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備進(jìn)行穗花杉莖段腋芽的誘導(dǎo),每瓶培養(yǎng)基接1個(gè)莖段,溫度(25±1)℃,光照人為控制進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn).采用帶節(jié)莖段,經(jīng)不同激素配比的組合實(shí)驗(yàn),1～2次轉(zhuǎn)接后,誘導(dǎo)腋芽萌發(fā).基本培養(yǎng)基有兩種:一種為MB,附加激素NAA4水平和KT3水平,采用全面試驗(yàn)法;另一種為1/2MS,附加活性炭,NAA、BA、KT3激素3水平采用正交試驗(yàn)法,進(jìn)行腋芽誘導(dǎo)試驗(yàn).1.2.5試苗帶節(jié)莖段培養(yǎng)誘導(dǎo)出的腋芽苗轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基,一部分待苗長(zhǎng)至2cm長(zhǎng)以后,切取試管苗帶節(jié)莖段,循環(huán)取材再培養(yǎng),誘導(dǎo)腋芽,一部分則誘導(dǎo)不定根.采用1/2MS基本培養(yǎng)基,3種配方:壯1加NAA0.1mg/L;壯2加IBA0.1mg/L;壯3為基本培養(yǎng)基.記錄發(fā)葉數(shù)和莖的長(zhǎng)度.1.2.6植物激素的誘導(dǎo)待壯苗培養(yǎng)基中的苗長(zhǎng)至8片葉以上,若高度不及2cm,莖較粗,基部有大團(tuán)愈傷組織,即可轉(zhuǎn)移到含不同植物激素IBA、NAA、KT、ZT的1/4MS培養(yǎng)基(MS大量元素減為1/4,其它減為1/2),附加蔗糖2.0%、瓊脂0.8%、pH值5.8,誘導(dǎo)不定根.2結(jié)果與分析2.1污染情況對(duì)土壤污染率的影響處理30d后,20瓶中有部分外植體污染,沒(méi)有污染的也有部分褐化,存活下來(lái)的一部分產(chǎn)生愈傷組織,一部分基本無(wú)變化,一部分節(jié)上膨大,可望產(chǎn)生腋芽.具體處理方法及結(jié)果見(jiàn)表1.從表1可知,控制污染效果較好的有組合2(KMnO40.1%處理5min+70%酒精處理0.5min+0.1%升汞處理10min)和組合5(KMnO40.1%處理8min+70%酒精處理30s+0.1%升汞處理15min),污染率皆為30%,但后者褐化較嚴(yán)重;防止褐化效果最好的有組合1(KMnO40.1%處理5min+70%酒精處理0.1min+0.1%升汞處理5min),但是污染率較高;綜合污染數(shù)和褐化數(shù)分析存活率,材料最佳處理方法為組合2,外植體存活率為40%.2.2對(duì)愈傷組織和腋芽的誘導(dǎo)效果不同溫度及光照培養(yǎng)30d愈傷組織情況、50d腋芽誘導(dǎo)情況見(jiàn)表2.從表2可知,不同溫度(21、25℃)對(duì)愈傷組織和腋芽的誘導(dǎo)效果有差異,其中21℃對(duì)于莖段愈傷組織的發(fā)生率更高些,而25℃下培養(yǎng)有利于誘導(dǎo)腋芽發(fā)生;光照下愈傷組織略比暗培養(yǎng)下易發(fā)生,但對(duì)腋芽誘導(dǎo)沒(méi)有明顯影響.故在穗花杉組織培養(yǎng)中重點(diǎn)要注意溫度,光照可以不用考慮.2.3腋芽誘導(dǎo)試驗(yàn)在芽的誘導(dǎo)過(guò)程中成功分化了腋芽.組別1～12采用MB基本培養(yǎng)基,附加不同激素;組別13～21采用1/2MS基本培養(yǎng)基,附加不同激素,進(jìn)行腋芽誘導(dǎo)試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表3、圖1.表3中組合22～25表明,僅用生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素單獨(dú)進(jìn)行誘導(dǎo)都是難以成功的;組合1～12說(shuō)明,腋芽誘導(dǎo)以MB基本培養(yǎng)基+NAA0.5mg/L+KT1.5mg/L為最適,成功率為60%(第6組);1/2MS基本培養(yǎng)基+BA3.0mg/L+NAA2.0mg/L+KT0.5mg/L+活性炭0.3%(第18組)效果也較好,腋芽誘導(dǎo)率為50%.2.4激素對(duì)乳苗中、苗莖生長(zhǎng)的影響腋芽初步誘導(dǎo)出來(lái)后,似綠豆大小突起,在原培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢,故轉(zhuǎn)至壯苗培養(yǎng)基,促進(jìn)腋芽生長(zhǎng),利于生根.進(jìn)行此項(xiàng)試驗(yàn)時(shí),共有無(wú)污染腋芽84瓶,每組合都試驗(yàn)28瓶,每瓶23～24mL.培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表4.從表4可知,附加激素IBA0.1mg/L的壯苗培養(yǎng)基壯2上生長(zhǎng)的試管苗發(fā)葉最多,而不加任何激素的培養(yǎng)基壯3上生長(zhǎng)的試管苗莖伸長(zhǎng)最多.若想擴(kuò)大繁殖系數(shù),循環(huán)取材,可將腋芽苗轉(zhuǎn)接入不加激素的培養(yǎng)基中促其莖伸長(zhǎng),長(zhǎng)至2cm以后,可切除上半部約1cm莖段轉(zhuǎn)接到腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,使之芽生芽或“以芽還芽”;若直接促其生根,則先將其轉(zhuǎn)入附加IBA0.1mg/L的壯苗培養(yǎng)基壯2上促進(jìn)發(fā)葉、強(qiáng)壯,而后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基.2.5穗花杉試管苗的生根共28瓶,轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基.添加激素IBA、NAA、KT、ZT.結(jié)果見(jiàn)表5、圖2.從表5可知,穗花杉試管苗在適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)素配比下(IBA4mg/L+NAA2mg/L)可以生根,而且根生長(zhǎng)良好,培養(yǎng)基中不宜加入分裂素.實(shí)驗(yàn)中,根是在愈傷組織團(tuán)上形成,屬于不定根.這是裸子植物組織培養(yǎng)上的一項(xiàng)成果,也是珍稀保護(hù)植物種質(zhì)資源保存的一項(xiàng)成果.3誘導(dǎo)腋芽發(fā)生(1)腋芽分化的最適培養(yǎng)基為MB(1/2MS+B5)+KT1.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖2.0%+瓊脂0.8%,腋芽誘導(dǎo)率可達(dá)60%.培養(yǎng)基1/2MS+6-BA3.0mg/L+NAA2.0mg/L+KT0.5mg/L+活性炭0.3%+蔗糖2.5%+瓊脂0.8%效果也不錯(cuò),腋芽發(fā)生率可達(dá)50%.(2)最適試管苗發(fā)葉壯苗培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.1mg/L+瓊脂0.8%+蔗糖2.0%.不加任何激素的1/2MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的試管苗莖伸長(zhǎng)最多.若要誘導(dǎo)生根,可采用前者;若想循環(huán)取材繁殖,可以采用后者.(3)成功誘導(dǎo)不定根的培養(yǎng)基為1/4MS+IBA4mg/L+NAA2mg/L+瓊脂0.8%+蔗糖2.0%.(4)材料最佳處理組合為KMnO40.1%處理5min+70%酒精處理0.5min+0.1%升汞處理10min.在2