無(wú)菌制劑車(chē)間環(huán)境微生物污染情況監(jiān)測(cè)

Part1、材料和方法

1.1

材料胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基及胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基均購(gòu)自北京奧愽星生物有限公司。VITEK2Compact自動(dòng)微生物快速檢測(cè)分析系統(tǒng)（法國(guó)生物梅里埃公司）；Phoenix-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀（美國(guó)海凈納（原美國(guó)杜邦）公司）1.2

方法1.2.1

質(zhì)控菌株鑒定取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌和大腸埃希菌的1代培養(yǎng)物接種至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，于30~35℃培養(yǎng)18h，刮取菌苔用Phoenix-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀和VITEK2Compact自動(dòng)微生物快速檢測(cè)分析系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定，參數(shù)設(shè)置培養(yǎng)溫度為36℃，菌液濁度為0.5麥?zhǔn)蠞岫龋∕CF）。1.2.2

樣品的采集根據(jù)GMP車(chē)間、周?chē)h(huán)境的房間數(shù)量和面積，對(duì)所有可能影響到產(chǎn)品質(zhì)量和易受微生物污染的關(guān)鍵部位進(jìn)行微生物樣本采集。同時(shí)采集生產(chǎn)人員、設(shè)備等生產(chǎn)環(huán)節(jié)的微生物樣本。主要采集2016—2018年的人員及設(shè)備表面微生物、沉降菌、浮游菌共345株，每個(gè)季度采集1次。①人員：采用壓指試驗(yàn)、表面接觸（頭、胸、手腕、肘、膝蓋）平皿；②設(shè)備：表面擦拭；③環(huán)境：沉降菌（A級(jí)、B級(jí)、C級(jí)、D級(jí)）、浮游菌（A級(jí)、B級(jí)）［4-7］。將所有的平皿置于30~35℃培養(yǎng)不少于3d。1.3

環(huán)境微生物菌型檢測(cè)將所培養(yǎng)的單菌落進(jìn)行劃線分離，得到的單菌落轉(zhuǎn)接營(yíng)養(yǎng)肉湯置-80℃冷凍保存。同時(shí)進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，并進(jìn)行革蘭染色，根據(jù)染色結(jié)果選擇后繼菌種鑒定需要的是陽(yáng)性還是陰性鑒定卡。然后按照VITEK2Compact自動(dòng)微生物快速檢測(cè)分析系統(tǒng)或Phoenix-100

全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀說(shuō)明書(shū)中的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行測(cè)定，一般2~10h給出鑒定結(jié)果。其中在Phoenix-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀上同時(shí)進(jìn)行細(xì)菌藥敏性試驗(yàn)。菌種鑒定實(shí)驗(yàn)過(guò)程：（1）將分離純化的新鮮菌苔用無(wú)菌棉拭子加入到相應(yīng)的菌種鑒定用培養(yǎng)液中，調(diào)節(jié)麥?zhǔn)蠞舛鹊?.5，并混勻。（2）將菌液從菌種鑒定卡上端的加樣口緩慢加入。（3）掃描菌種鑒定卡后面的條碼，儀器自動(dòng)識(shí)別后裝入儀器，開(kāi)始運(yùn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，讀取報(bào)告。藥敏試驗(yàn)過(guò)程：（1）使用之前，把藥敏指示劑溶液添加到藥敏培養(yǎng)液試管中并保存在黑暗中達(dá)8h。只用1滴從滴瓶自由落下的藥敏指示劑溶液。（2）將分離純化的新鮮菌苔用無(wú)菌棉拭子加入到相應(yīng)的菌種鑒定用培養(yǎng)液中，調(diào)節(jié)麥?zhǔn)蠞舛鹊?.5，并混勻。（3）用移液槍吸取25μL上述菌液加入到藥敏培養(yǎng)液試管中。（4）將菌液從菌種鑒定及藥敏鑒定卡上端的加樣口緩慢加入。（5）掃描菌種鑒定卡后面的條碼，儀器自動(dòng)識(shí)別后裝入儀器，開(kāi)始運(yùn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，讀取報(bào)告。Part2、結(jié)果

2.1

質(zhì)控菌株檢測(cè)結(jié)果用VITEK2Compact自動(dòng)微生物快速檢測(cè)分析系統(tǒng)或Phoenix-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀生物檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)上述已知的金黃色葡萄球菌等共4株標(biāo)準(zhǔn)菌株作為質(zhì)控菌株進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)菌株完全相符，可信度在98%

以上，見(jiàn)表1。2.2

環(huán)境微生物鑒定結(jié)果通過(guò)對(duì)所收集的環(huán)境菌共樣本345個(gè)樣品檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行整理和分析。檢出的微生物115株（其中人員及設(shè)備表面微生物4株，浮游菌6株，沉降菌105株）為46種菌種，分別來(lái)自20個(gè)菌屬。排在前3位的是葡萄球菌屬共48株，庫(kù)克菌屬共16株，鞘氨醇單胞菌屬共13株，其余的菌屬包括埃希氏桿菌屬、棒狀桿菌屬、巴斯德氏菌、伯克氏菌屬、腸球菌屬、泛菌屬、假單胞菌屬、顆粒鏈菌屬、克雷伯菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬、氣單孢菌屬、沙雷氏菌屬、威克斯菌屬、微球菌屬、芽孢桿菌屬、耶爾森氏菌屬。根據(jù)革蘭氏染色結(jié)果分類(lèi)，革蘭氏陽(yáng)性總共92株，占總數(shù)80%；革蘭氏陰性總共23株，占總數(shù)的20%。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明：（1）浮游菌、人員及表面微生物共10株，以葡萄球菌革蘭氏陽(yáng)性球菌為主占60%，其次為居泉沙雷菌及成團(tuán)泛菌等革蘭氏陰性桿菌占30%。（2）沉降菌共105株，葡萄球菌屬、庫(kù)克菌屬、鏈球菌屬等革蘭氏陽(yáng)性球菌占71%；其次為鞘氨醇單胞菌、氣單孢菌屬、假單胞菌屬等革蘭氏陰性桿菌占22%；革蘭氏陽(yáng)性桿菌占1%；革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌占6%。詳細(xì)見(jiàn)圖1和圖2。其中檢出3株葡萄球菌具有耐藥性。檢出的其中1株耐藥菌的耐藥特征見(jiàn)圖3。2.3

潔凈區(qū)微生物污染分析2.3.1

Ａ級(jí)區(qū)污染微生物結(jié)果分析該企業(yè)Ａ級(jí)區(qū)環(huán)境菌監(jiān)控結(jié)果，共收集到4株微生物，占污染微生物總數(shù)的3.5%。3株為少動(dòng)鞘氨醇單胞菌，1株為庫(kù)克菌。在Ａ級(jí)區(qū)的微生物污染物數(shù)量、類(lèi)型相對(duì)較少。說(shuō)明A級(jí)區(qū)的微生物隔離系統(tǒng)起到了很好的隔離作用。也有可能是因?yàn)椴僮魅藛T較少的緣故。2.3.2

Ｂ級(jí)和Ｃ級(jí)區(qū)污染微生物結(jié)果分析Ｂ級(jí)和Ｃ級(jí)區(qū)共收集到111株微生物，占污染物總數(shù)的96.5%。環(huán)境微生物監(jiān)控分離微生物仍以葡萄球菌屬為主，合計(jì)48株（占Ｂ級(jí)和Ｃ級(jí)區(qū)總分離株的43.2%）。其中，沃氏葡萄球菌、腐生葡萄球菌和金黃色葡萄球菌分別占Ｂ級(jí)和Ｃ級(jí)區(qū)總分離株的8.1%、6.3%

和5.4%，且多分布在更衣室和潔凈走廊、消毒室，可見(jiàn)微生物污染與人員活動(dòng)密切相關(guān)。2.3.3

表面污染微生物結(jié)果分析采集到操作人員和設(shè)備表面微生物共4株均來(lái)自Ｂ級(jí)和Ｃ級(jí)區(qū)，占全部污染菌總數(shù)的3.5%。2株為葡萄球菌，1株為棒狀桿菌，1株為氣單胞菌。Part3、討論

3.1

微生物污染源分析從菌型分析結(jié)果可知，該無(wú)菌制劑生產(chǎn)企業(yè)潔凈區(qū)人員及設(shè)備表面微生物及沉降菌樣品檢出率最高的是革蘭陽(yáng)性菌，而居其首位的是葡萄菌屬，此類(lèi)菌廣泛存在自然界中，是人體的皮膚及呼吸道黏膜表面的正常菌群，當(dāng)機(jī)體免疫力低下時(shí)可引起各種疾病［8］。其次為庫(kù)克菌屬，此類(lèi)菌主要分布在水、土壤等自然環(huán)境中以及哺乳動(dòng)物、人的皮膚、黏膜和口咽部。以往認(rèn)為克氏庫(kù)克菌是很少見(jiàn)的條件致病菌，未引起足夠的重視。近年來(lái)由該菌引發(fā)的感染增加較快，特別是血流感染和皮膚軟組織感染［9-10］。另外，最近楊銳等［11］從醫(yī)務(wù)人員手、皮膚黏膜、物體表面、空氣等醫(yī)療環(huán)境樣本中已檢出８株克氏庫(kù)克菌。第3位為鞘氨醇單胞菌，是一種能夠合成生物聚合物的重要微生物菌種資源。潔凈區(qū)檢出均為人員帶入，進(jìn)入凈化區(qū)，樹(shù)立無(wú)菌觀念，從根本上降低污染的發(fā)生。從各區(qū)域微生物分離數(shù)量看，A級(jí)區(qū)的微生物污染數(shù)量明顯比B級(jí)和C級(jí)區(qū)的微生物污染數(shù)量小很多，符合區(qū)域隔離和空氣凈化的規(guī)律［12-13］。3.2

制藥企業(yè)微生物污染監(jiān)測(cè)作用3.2.1

評(píng)價(jià)無(wú)菌車(chē)間滅菌程序的有效性無(wú)菌制劑車(chē)間環(huán)境微生物污染檢測(cè)可以評(píng)價(jià)無(wú)菌車(chē)間滅菌程序的有效性，可以根據(jù)微生物種類(lèi)選擇適宜的消毒劑。該制藥企業(yè)分離的微生物采集到的微生物91%以上為沉降菌。除了加強(qiáng)消毒驗(yàn)證，還要注意高效過(guò)濾系統(tǒng)的清洗和更換頻率是否滿足要求。3.2.2

建立警戒線和糾偏限通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)的分析建立警戒線和糾偏限，當(dāng)出現(xiàn)某種微生物或微生物指標(biāo)超限時(shí)就應(yīng)啟動(dòng)滅菌程序。系統(tǒng)的關(guān)鍵參數(shù)比如微生物指標(biāo)超出正常范圍但未達(dá)到糾偏限度，需要引起警覺(jué)，可能需要采取糾正措施的限度標(biāo)準(zhǔn)為糾偏限度；系統(tǒng)的關(guān)鍵參數(shù)比如微生物指標(biāo)超出可接受標(biāo)準(zhǔn)，需要進(jìn)行調(diào)查并采取糾正措施的限度標(biāo)準(zhǔn)。制訂警戒限度和糾偏限度方式：（1）（臨界值法）對(duì)一個(gè)時(shí)期內(nèi)所有數(shù)據(jù)以柱狀圖模式給出，原則取最近100個(gè)采樣數(shù)據(jù)，以第95區(qū)間和第99區(qū)間作為警戒限度和糾偏限度；（2）（正態(tài)分布法）警戒限度

=

平均值

+2σ；糾偏限度

=

平均值+3σ［14］。3.2.3

對(duì)污染菌進(jìn)行溯源分析當(dāng)監(jiān)測(cè)結(jié)果超出糾偏限度時(shí)，則必須立刻啟動(dòng)偏差管理系統(tǒng)或管理系統(tǒng)，對(duì)系統(tǒng)超標(biāo)的原因進(jìn)行調(diào)查，環(huán)境檢測(cè)建立的數(shù)據(jù)庫(kù)可以進(jìn)行溯源分析，幫助判斷是哪一環(huán)節(jié)出現(xiàn)了問(wèn)題［15］。根據(jù)2010年版GMP要求，若無(wú)菌產(chǎn)品檢查結(jié)果出現(xiàn)陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)進(jìn)行原因調(diào)查。隨著藥品檢驗(yàn)技術(shù)和理念的不斷更新，《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版微生物檢查法愈加關(guān)注生產(chǎn)過(guò)程中的微生物控制，強(qiáng)調(diào)通過(guò)“實(shí)驗(yàn)室調(diào)查回顧、利用適宜方法”分析檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。調(diào)查回顧涉及到藥品生產(chǎn)檢驗(yàn)的人、機(jī)、料、法、環(huán)5個(gè)方面。而我們的實(shí)驗(yàn)對(duì)GMP車(chē)間人員，設(shè)備和空氣系統(tǒng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，建立了該企業(yè)凈化區(qū)的微生物數(shù)據(jù)庫(kù)，當(dāng)樣品中檢出陽(yáng)性時(shí)，可以對(duì)檢出菌與數(shù)據(jù)庫(kù)中菌進(jìn)行鑒別比對(duì)，同源性分析，找到可能的污染源，幫助企業(yè)采取高效有針對(duì)性的糾偏措施［16］。3.2.4

對(duì)污染菌進(jìn)行耐藥分析在檢出的細(xì)菌中有3株耐藥菌，均為葡萄球菌屬；1株為腐生葡萄球菌，能產(chǎn)青霉素酶，對(duì)吉他霉素、青霉素G、紅霉素、和莫匹羅星產(chǎn)生耐藥；1株為表皮葡萄球菌，能產(chǎn)青霉素酶，對(duì)苯唑西林、青霉素G耐藥；1株為沃氏葡萄球菌能產(chǎn)青霉素酶，對(duì)妥布霉素、青霉素G和紅霉素耐藥。β-

內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素共同具有1個(gè)核心β-

內(nèi)酰胺環(huán)，其基本作用機(jī)制是與細(xì)菌的青霉素結(jié)合蛋白結(jié)合，從而抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成；β-

內(nèi)酰胺酶借助其分子中的絲氨酸活性位點(diǎn)，與β-

內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)合并打開(kāi)β-

內(nèi)酰胺環(huán)，導(dǎo)致青霉素類(lèi)藥物失活，產(chǎn)生耐藥性［17］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，環(huán)境中人葡萄球菌和表皮葡萄球菌對(duì)頭孢類(lèi)、氨基苷類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和氟喹諾酮類(lèi)藥物敏感；人葡萄球菌和溶血葡萄球菌對(duì)四環(huán)素類(lèi)藥物敏感；葡萄球菌對(duì)磺胺類(lèi)藥物有不同程度的耐藥［18-