牛體外受精技術(shù)胚胎應(yīng)用效果的比較研究

牛體外受精技術(shù)胚胎應(yīng)用效果的比較研究

1982年，brackt等人首次報道了世界上第一個移動基因（ivf）牛，引起了生物科學(xué)家的高度興趣。特別是牛外科技術(shù)的發(fā)展迅速，理論和方法也更加成熟和完善。它是動物胚胎工程的基礎(chǔ)和重要研究分支，在20世紀(jì)80年代末開始開發(fā)。在中國,家畜繁殖技術(shù),尤其是牛的胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)發(fā)展很快,已初步具備產(chǎn)業(yè)化條件,發(fā)展前景廣闊(王新武,2002)。牛擴繁產(chǎn)業(yè)化的技術(shù)分為體內(nèi)胚生產(chǎn)和體外胚生產(chǎn)。體內(nèi)胚生產(chǎn)即用常規(guī)的人工授精方法進(jìn)行配種,而體外胚生產(chǎn)即體外授精技術(shù)。胚胎的體外生產(chǎn)技術(shù)包括超聲監(jiān)視下活體取卵(ovumpickup,OPU)、體外成熟、體外授精、體外培養(yǎng)及性別控制/性別鑒定等技術(shù)(張忠誠,2002),而性控胚技術(shù)的目的是獲得大量優(yōu)良遺傳性狀并已知性別的胚胎,用于胚胎移植,以快速獲得良種牛群。OPU技術(shù)與IVF技術(shù)的有機結(jié)合不僅加快了優(yōu)秀個體的繁殖速度,同時也解決了體外授精技術(shù)優(yōu)秀卵母細(xì)胞的來源和胚胎系譜的問題(Pieterse等,1991),但是,IVF胚胎的質(zhì)量是否與體內(nèi)胚胎相當(dāng)也一直飽受爭議。作者對IVF胚胎與體內(nèi)胚胎的移植妊娠率及出生后牛的性別比例、性控IVF與非性控IVF胚胎的囊胚發(fā)育率進(jìn)行了比較,對性控IVF及非性控IVF的胚胎進(jìn)行了性別鑒定,以期為性別控制胚胎擴繁技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的推廣應(yīng)用提供參考。1材料和方法1.1試驗材料1.1.1卵母細(xì)胞卵母細(xì)胞由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳研究所松江實驗基地提供。1.1.2西5.出/建筑節(jié)能型非性控精液購自上海奶牛育種中心,公牛號:30201,批號:20050312;性控精液購自大慶市田豐生物工程公司,公牛號:02129,批號:20050505。1.1.3資料與實驗材料卵母細(xì)胞成熟液IVMD-101、受精液IVF-100均購自日本IFP;胚胎培養(yǎng)液ACM為上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所克隆實驗室配制(李曉晨等,2009)。其余試劑均購自美國Sigma公司。1.2測試方法1.2.1卵丘細(xì)胞的培養(yǎng)在超聲儀監(jiān)視下活體取卵,取出卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)放入成熟液(IVMD-101)中,5%CO2,38.5℃,飽和濕度下培養(yǎng)22～24h,將成熟的卵母細(xì)胞在受精液(IVF-101)中洗滌多次,去除多余的卵丘細(xì)胞,使卵母細(xì)胞周圍保留2～3層的卵丘細(xì)胞。1.2.2受香精液處理非性控精液和性控精液均分別使用同一個體公牛的同一批號凍精。37℃水浴迅速解凍精液,將解凍后的精子置于3mL左右的受精液中,輕柔混勻后,2500r/min離心5min,棄去上清液,加入3mL受精液,輕柔混勻,以相同轉(zhuǎn)速和時間再離心1次,棄去上清,用1mL左右受精液重懸沉淀。1.2.3精子與卵母細(xì)胞的培養(yǎng)調(diào)整精子終濃度在2×106～3×106/mL(性控精液精子終濃度控制為4×106～5×106/mL),精子與卵母細(xì)胞于5%CO2、38.5℃、飽和濕度下共培養(yǎng)6～7h。將受精卵放入上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所克隆實驗室自配的ACM培養(yǎng)液中于5%CO2、38.5℃、飽和濕度下培養(yǎng)。受精后48h統(tǒng)計卵裂率,第8天統(tǒng)計囊胚率。1.2.4麻醉后體移植將裝有胚胎的移植管裝入移植套管再裝入移植槍內(nèi),移植套膜套在最外層,將受體母牛站立保定,用1mL麻醉劑“864”肌注及2mL利多卡因尾椎硬膜外麻醉,清除直腸糞便,消毒外陰后,將移植槍緩慢推至子宮角處進(jìn)行胚胎移植。受體母牛移植60d后仍未返情,則通過直腸觸診診斷受孕情況。1.2.5胚胎的性別鑒定將冷凍管(裝有1枚胚胎,培養(yǎng)液約10μL,)解凍,胚胎吹入洗滌小皿,在PBS液中洗3次,然后分別將1枚胚胎吸入1個PCR管中,立即加去離子水10μL、95℃加熱裂解10min,之后用PCR擴增進(jìn)行胚胎的性別鑒定。1.2.6sry基因核心序列根據(jù)?；蚪M特異性DNA序列和Y染色體的性別決定區(qū)(SRY)核心序列設(shè)計PCR引物(表1)。內(nèi)源對照特異性引物:采用引物YY1、YY2,反應(yīng)體積25μL,包含DNA2.5μL(鑒定的1枚囊胚的裂解DNA于10μL水中)。反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性5min;94℃變性45s,55℃退火30s,72℃延伸1min,35個循環(huán);72℃延伸10min。SRY基因核心序列特異引物:第一次擴增:引物C1、C2,反應(yīng)體積25μL,包含DNA2.5μL。反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性5min;94℃變性45s,55℃退火30s,72℃延伸1min,20個循環(huán)。第二次擴增:引物C2、C3,反應(yīng)體積25μL(含第一次擴增產(chǎn)物10μL)。反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性5min;94℃變性45s,55℃退火30s,72℃延伸1min,35個循環(huán)。取PCR產(chǎn)物15μL,用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,EB染色顯影并拍照。1.2.7統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行χ2檢驗,P<0.05為差異顯著。2結(jié)果與分析2.1民法上的受體民法選擇同步發(fā)情處理的母牛作為移植胚胎受體母牛,每頭受體牛移植一枚IVF囊胚,共移植了30頭受體母牛,同時用人工受精的69頭受體母牛作為對照。移植60d后經(jīng)直腸觸診診斷,結(jié)果顯示,IVF組有12頭受體母牛懷孕,妊娠率為40.0%;體內(nèi)胚胎組有28頭受體母牛懷孕,妊娠率為40.6%,兩組妊娠率無顯著性差異(P=0.957)(表2)。2.2工駝峰試驗結(jié)果試驗用Y染色體的性別決定區(qū)(SRY)核心序列進(jìn)行PCR,對牧場普通人工受精及普通IVF的試驗牛作了性別比例統(tǒng)計,結(jié)果顯示,兩者的公牛比例分別為51.7%與66.7%(P=0.041)(表3),存在顯著性差異(P<0.05),即普通IVF出生的公牛比例明顯高于常規(guī)人工受精。2.3普通iiif胚胎與性控不同性別比例通過PCR擴增的方法對普通IVF胚胎與性控IVF胚胎進(jìn)行了性別鑒定,結(jié)果顯示,普通IVF胚胎公牛比例(60.9%)顯著高于性控IVF胚胎的公牛比例(11.5%)(P<0.0001)(表4)。2.4顯著性差異檢驗普通精液IVF胚胎卵裂率為73.1%±3%,性控精液IVF卵裂率為57.7%±10%(P=0.001),存在顯著性差異;然而普通精液IVF囊胚率與性控精液IVF囊胚率分別為40.4%±13%與36.6%±8%,無顯著性差異(P=0.530)(表5)。3擴繁性別控制技術(shù)由于傳統(tǒng)育種方式周期長、速度慢,無法滿足國家經(jīng)濟發(fā)展及人民日益增長的物質(zhì)需求,因此,體外受精性控胚擴繁技術(shù)能夠加快優(yōu)質(zhì)奶牛群的建立,是迅速擴大良種畜群的有效手段之一。本研究比較了IVF胚胎與體內(nèi)胚胎的妊娠率,結(jié)果顯示,IVF胚胎移植妊娠率與體內(nèi)胚胎妊娠率無顯著性差異,證實IVF胚胎與體內(nèi)胚胎的質(zhì)量相當(dāng)。另外,研究結(jié)果表明,IVF胚胎基本保持了正常胚胎的基因特性(Smith等,2009)。因此,應(yīng)用良種牛IVF胚胎可提高牛肉、奶類的產(chǎn)量和品質(zhì),有著顯著效果和重要的經(jīng)濟價值,而通過OPU技術(shù)取卵可大大降低生產(chǎn)成本,這是傳統(tǒng)體內(nèi)胚胎所無法比擬的,而且由于全部程序均在體外操作完成,這為IVF牛胚胎的大批量生產(chǎn)達(dá)到產(chǎn)業(yè)化規(guī)模提供了更廣闊的發(fā)展空間。在胚胎產(chǎn)業(yè)化中,為了充分發(fā)揮母畜的繁殖潛力和公畜的生長優(yōu)勢,進(jìn)而提高畜牧業(yè)的經(jīng)濟效益,排除畜群中有害基因和基因型,防止性連鎖疾病,提高優(yōu)良畜群的繁殖速度,研究者一直在進(jìn)行控制家畜性別的研究(Underwood等,2010;Hochman等,1996;Palma等,2004)。目前對家畜性別的控制主要有兩種方式,一是應(yīng)用性控精液(Palma等,2008),二是進(jìn)行早期胚胎的性別鑒定(曾溢滔等,1993)。本研究統(tǒng)計了牧場人工受精出生牛及普通IVF出生牛的性別比例,結(jié)果發(fā)現(xiàn),常規(guī)普通精液人工受精出生牛及普通IVF出生牛的公牛比例分別為51.7%、66.7%,說明IVF的公牛明顯高于理論值(50%);采用性控和非性控精液進(jìn)行IVF試驗,并應(yīng)用PCR擴增牛SRY核心序列進(jìn)行奶牛胚胎性別鑒定,說明普通IVF胚胎公牛的比例達(dá)60.9%,同樣高于理論值(50%);而用性控精液進(jìn)行IVF胚胎的公牛比例為11.5%,即性控IVF胚胎的公牛比例比普通IVF胚胎的公牛