黃柏中粗黃酮提取工藝研究

黃柏中粗黃酮提取工藝研究

西蘭花也被稱為金針菜。有一天，百合會(huì)微笑著死去。它通常被稱為金針蔬菜，屬于百合科玄草科。明代李時(shí)珍在《本草綱目》中謂其有安神醒腦、增智寬胸、美顏養(yǎng)血、解熱消毒、除煩通乳之功效。其主要化學(xué)成分有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物,還有多種維生素、生物堿、苷、黃酮類(lèi)、胡蘿卜素、揮發(fā)油、鞣質(zhì)以及無(wú)機(jī)礦物鈣、磷等。據(jù)《中藥大辭典》記載,黃花菜含有生物堿0.7%,苷1.8%,黃酮類(lèi)0.75%,β-胡蘿卜素0.36%。黃花菜總黃酮是其重要有效成分之一,它具有增強(qiáng)免疫力、活血化瘀、保肝抗炎、抗菌抗病毒、抑制腫瘤、延緩衰老、抗氧化自由基活性作用等多種保健功能。因此近年來(lái)黃酮類(lèi)化合物成為新藥開(kāi)發(fā)研究中的一個(gè)非常重要的資源,具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景,本實(shí)驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)回流法提取黃花菜粗黃酮的最佳條件進(jìn)行研究,采用單因素試驗(yàn)對(duì)超聲法提取黃花菜總黃酮的最佳條件進(jìn)行研究,以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定總黃酮含量為指標(biāo),探尋黃花菜總黃酮制備工藝,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)可利用資源提供理論依據(jù)。1材料表面1.1材料預(yù)處理稱取過(guò)60目篩黃花菜干燥粉末樣品5.00g置于索氏提取器中,加120mL乙醚回流4h,脫至無(wú)色,自然風(fēng)干備用。1.2樣品的制備精確稱取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.1520g,置于250mL容量瓶中,用30%乙醇溶解并定容至250mL,搖勻即得濃度為0.608mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液。量取上述溶液0.0mL,1.2mL分別于25mL容量瓶,加30%的乙醇約至12.5mL,加5%的亞硝酸鈉溶液0.8mL,放置5min,加5%的硝酸鋁溶液0.8mL,搖勻,放置6min,后加4%的氫氧化鈉溶液5mL,30%的乙醇定容至刻度,混勻,放置15min。以加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0mL的處理液為參比液,對(duì)加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品1.2mL的處理液在400~800nm范圍內(nèi)掃描,得到其吸收光譜,測(cè)得最大吸收波長(zhǎng)為510nm。以相同方法將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液換為提取液處理后,測(cè)得吸收光譜最大吸收波長(zhǎng)同樣為510nm。據(jù)上可知可用蘆丁作為黃花菜的黃酮測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)品,顯色反應(yīng)后,在最大吸收波長(zhǎng)510nm處測(cè)吸光度。1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線方程準(zhǔn)確移取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.00、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00、2.40mL于25mL容量瓶中,以上述方法顯色反應(yīng)后,在510nm處測(cè)得吸光度。以吸光度(Abs)為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)作圖。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.00787C-0.00911,R2=0.9993。根據(jù)A與濃度C的關(guān)系可繪制出線性很好的標(biāo)準(zhǔn)曲線。說(shuō)明黃酮的質(zhì)量濃度在0~58.3680mg/L范圍內(nèi),A與質(zhì)量濃度C之間呈良好的線性關(guān)系,可按標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析。1.4硝酸鹽總總反應(yīng)物吸光度的測(cè)定準(zhǔn)確稱取1.0mL提取液于50mL容量瓶中,加30%的乙醇約至25mL,加5%的亞硝酸鈉溶液0.8mL,放置5min,加5%的硝酸鋁溶液0.8mL,搖勻,放置6min,后加4%的氫氧化鈉溶液5mL,30%的乙醇定容至刻度,混勻,放置15min,用紫外分光光度計(jì)在510nm處測(cè)其吸光度。2方法2.1返回提取法2.1.1單因素實(shí)驗(yàn)2.1.1.固液比的篩選分別準(zhǔn)確稱取黃花菜粉末5.00g,置于索氏提取器中,當(dāng)溫度調(diào)至95℃時(shí),分別以1︰8、1︰10、1︰12、1︰14、1︰16的固液比加75%乙醇回流提取2h,以確定最佳提取固液比。按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法用紫外分光光度計(jì)在510nm處測(cè)其吸光度。由圖2可知,固液比為1︰12時(shí)樣品含量測(cè)定結(jié)果所得吸光度很大,且與最大值相差不大,因此,可確定回流提取的最佳固液比為1︰12。2.1.1.提取溫度的確定分別準(zhǔn)確稱取黃花菜粉末5.00g,置于索氏提取器中,溫度分別調(diào)至80、85、90、95、100℃時(shí),以1︰12的固液比加入75%乙醇回流提取2h,以確定最佳提取溫度。按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法用紫外分光光度計(jì)在510nm處測(cè)其吸光度。由圖3可知,提取溫度T=95℃時(shí),樣品含量測(cè)定結(jié)果所得吸光度有最大值,因此可確定提取溫度因素的最佳實(shí)驗(yàn)條件為T(mén)=95℃,因?yàn)槠鋬蓚?cè)水平所得樣品吸光度高于其他,因此確定正交試驗(yàn)的提取溫度因素的三個(gè)水平為:T=90℃,T=95℃,T=100℃。2.1.1.提取醇濃度的確定分別準(zhǔn)確稱取黃花菜粉末5.00g,置于索氏提取器中,在95℃下,1︰12的固液比加入75%、80%、85%、90%、95%乙醇回流提取2h,以確定最佳提取醇濃度。由圖4可知,當(dāng)醇濃度=95%時(shí),樣品含量測(cè)定結(jié)果所得吸光度有最大值,因此可確定醇濃度因素的最佳實(shí)驗(yàn)條件為95%,因?yàn)槠鋬蓚?cè)水平與其相差不大,因此確定正交試驗(yàn)的醇濃度因素的3個(gè)水平為:85%,90%,95%。2.1.1.最佳提取時(shí)間的測(cè)定分別準(zhǔn)確稱取黃花菜粉末5.00g,置于索氏提取器中,95℃,1︰12的固液比加入85%乙醇分別回流提取1、1.5、2、2.5、3h,以確定最佳提取時(shí)間。按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法用紫外分光光度計(jì)在510nm處測(cè)其吸光度。由圖5可知,提取時(shí)間t=2.5h時(shí),樣品含量測(cè)定結(jié)果所得吸光度有最大值,因此可確定提取溫度因素的最佳實(shí)驗(yàn)條件為t=2.5h,因?yàn)閠=3h所得樣品吸光度開(kāi)始降低,說(shuō)明時(shí)間延長(zhǎng)并不能提高黃酮提取效率的率,因此,從省時(shí)高效角度確定正交試驗(yàn)的提取溫度因素的3個(gè)水平為:t=1.5h,t=2h,t=2.5h。2.1.2正交實(shí)驗(yàn)2.1.2.1.正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表12.1.2.提取、溶解方法準(zhǔn)確稱取黃花菜粉末5.00g,將其包成藥包置于索氏提取器中,按上述正交表逐一進(jìn)行提取,濃縮,溶解,含量測(cè)定。見(jiàn)表2~3。比較各因素的極差可知因素A對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響最大,其次是B→C,所以各因素對(duì)黃酮提取效率影響大小順序?yàn)锳→B→C,通過(guò)正交試驗(yàn)得出的最佳提取工藝為A3B3C2,即醇濃度為95%,在95℃下提取2.5h。2.2超聲提取法2.2.1固液比的確定分別準(zhǔn)確稱取黃花菜粉末5.00g,分別以1︰8、1︰10、1︰12、1︰14、1︰16的固液比向錐形瓶中加入75%乙醇,后將錐形瓶放入超聲清洗器中,用鐵架臺(tái)固定住并超聲提取40min,以確定最佳提取固液比。按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法用紫外分光光度計(jì)在510nm處測(cè)其吸光度。2.2.2超聲提取時(shí)間的確定分別準(zhǔn)確稱取黃花菜粉末5.00g,分別以1︰12的固液比向錐形瓶中加入75%乙醇,后將錐形瓶放入超聲清洗器中,用鐵架臺(tái)固定住并分別超聲提取20、30、40、50、60min,以確定最佳提取提時(shí)間。按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法用紫外分光光度計(jì)在510nm處測(cè)其吸光度。2.2.3最佳提取醇濃度的確定分別準(zhǔn)確稱取黃花菜粉末5.00g,將藥材放入錐形瓶中,當(dāng)超聲清洗器的水溫調(diào)至55℃時(shí),以1︰12的固液比向錐形瓶中分別加入50%、60%、70%、80%、90%乙醇,后將錐形瓶放入超聲清洗器中,用鐵架臺(tái)固定住并分別超聲提取40min,以確定最佳提取醇濃度。按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法用紫外分光光度計(jì)在510nm處測(cè)其吸光度。由上述圖表分析可知,固液比為1︰16時(shí)樣品含量測(cè)定結(jié)果所得吸光度有最大值,但與1︰12時(shí)相差不大,從成本考慮,應(yīng)選用1︰12的固液比為宜。當(dāng)t=40min時(shí)樣品含量測(cè)定的吸光度有最大值,當(dāng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都能使提取效率降低。當(dāng)醇濃度為90%時(shí)吸光度最大,但當(dāng)醇濃度為80%時(shí)吸光度與90%時(shí)吸光度相接近,為了節(jié)約成本,在應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)時(shí),應(yīng)選用80%濃度的乙醇。3工藝優(yōu)化3.1水浴鍋提取液的制備分別準(zhǔn)確稱取黃花菜粉末5.00g,將其包成藥包置于索氏提取器中,當(dāng)水浴鍋的溫度調(diào)至95℃時(shí),以1︰12的固液比向150mL的平底燒瓶中加入95%乙醇回流提取2.5h,平行3次。按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法用紫外分光光度計(jì)在510nm處測(cè)其吸光度。3.2超聲提取法分別準(zhǔn)確稱取黃花菜粉末5.00g,將藥材放入錐形瓶中,當(dāng)超聲清洗器的水溫調(diào)至55℃時(shí),以1︰12的固液比向錐形瓶中分別加入90%乙醇,后將錐形瓶放入超聲清洗器中,用鐵架臺(tái)固定住并分別超聲提取40min,平行3次。按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法用紫外分光光度計(jì)在510nm處測(cè)其吸光度。3.3最佳提取工藝的確定提取效率與吸光度成正比,所以回流法提取效率高于超聲法的提取效率。所以黃花菜中粗黃酮提取的最佳工藝優(yōu)化為:以醇為溶劑且濃度為95%,在95℃下回流提取2.5h。由于不同地區(qū)的黃花菜生活環(huán)境不同,其所蘊(yùn)藏的黃酮含量有所差別,