不同飲食方式對(duì)sz糖尿病模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

不同飲食方式對(duì)sz糖尿病模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

隨著糖尿病（melarismelius，m）發(fā)病率的增加，基于簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、可靠和經(jīng)濟(jì)的糖尿病動(dòng)物模型越來(lái)越受到重視。鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)是一種氨基葡萄糖-亞硝基脲類化合物,能夠選擇性地破壞哺乳動(dòng)物胰島β細(xì)胞,從而誘發(fā)糖尿病,常用于糖尿病動(dòng)物模型的制備。然而STZ的劑量選擇、動(dòng)物的飲食等因素制約著模型的穩(wěn)定性。此外,有報(bào)道,糖尿病模型大鼠存在空間學(xué)習(xí)記憶能力下降,本文通過(guò)比較不同時(shí)間、劑量STZ尾靜脈注射配合不同飲食條件建立糖尿病大鼠模型,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)模型動(dòng)物血糖變化,探討應(yīng)用STZ制備穩(wěn)定可靠DM模型的方法,并通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力,為糖尿病學(xué)習(xí)記憶能力改變提供基礎(chǔ)性的研究。1材料和方法1.1材料表面1.1.1高脂飼料的制作SPF級(jí)雄性SD大鼠70只,體重(150±10)g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2006-0009】。高脂飼料,由基礎(chǔ)鼠飼料加蔗糖、煉豬油和蛋黃按比例搭配制作(豬油18%,蔗糖20%,蛋黃%,基礎(chǔ)飼料59%),購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2009-0008】。實(shí)驗(yàn)在中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障環(huán)境中進(jìn)行【SYXK(京)2010-0032】,并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。1.1.2儀器、試劑與儀器鏈脲佐菌素購(gòu)自Sigma公司(批號(hào):040M1357),檸檬酸(北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司,批號(hào):20091028),檸檬酸二鈉(北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司,批號(hào):20070828)。TG(批號(hào):110501)、CHO(批號(hào):100731),HDL-C(批號(hào):100401),LDL-C(批號(hào):100351)測(cè)定試劑盒購(gòu)至北京中生北控生物科技股份有限公司。HEA-215型血糖儀及配套試紙(歐姆龍,中國(guó))。Ethovision小動(dòng)物行為軌跡跟蹤分析系統(tǒng)(Noldus公司,荷蘭)。1.2方法1.2.1不同種類stz、常規(guī)膳食組見(jiàn)表1動(dòng)物購(gòu)進(jìn)后適應(yīng)性喂養(yǎng)4d,進(jìn)行隨機(jī)分組,根據(jù)飲食、STZ注射時(shí)間、劑量的不同分為7組,每組10只動(dòng)物,共70只,分別為:Ⅰ組:空白對(duì)照組;Ⅱ組:高糖高脂膳食組;Ⅲ組:0周STZ(30mg/kg)+高糖高脂膳食組;Ⅳ組:0周STZ(30mg/kg)+常規(guī)膳食組;Ⅴ組:6周STZ(20mg/kg)+高糖高脂膳食組;Ⅵ組:6周STZ(25mg/kg)+高糖高脂膳食組;Ⅶ組:6周STZ(30mg/kg)+高糖高脂膳食組。1.2.2檸檬酸緩沖液的制備檸檬酸緩沖液的配置:取檸檬酸(FW:210.14)2.1g加入超純水100mL中配成A液,取檸檬酸二鈉(FW:294.10)2.94g加入超純水100mL中配成B液,將A、B液按1∶1比例混合,用pH計(jì)測(cè)定pH值,調(diào)到pH值4.2~4.5之間,即為所需的檸檬酸緩沖液。STZ的配置:注射前用檸檬酸緩沖液以1%的濃度溶解STZ,溶解后30min內(nèi)注射完畢,現(xiàn)用現(xiàn)配,置于冰浴中。1.2.3尾靜脈stz注射動(dòng)物購(gòu)進(jìn)后,常規(guī)飲食、水,適應(yīng)4d,于注射STZ前禁食12h(20:00至次日8:00),根據(jù)分組情況,III組、IV組大鼠尾靜脈注射30mg/kgSTZ。高糖高脂膳食組尾靜脈注射同等劑量的檸檬酸緩沖液。注射后根據(jù)分組情況分別給予常規(guī)與高脂飲食。實(shí)驗(yàn)第6周,V組大鼠尾靜脈注射STZ(20mg/kg);Ⅵ組注射STZ(25mg/kg);VII組注射STZ(30mg/kg)。1.2.4血液測(cè)試于尾靜脈注射STZ72h后,剪尾法取血,歐姆龍血糖儀測(cè)定大鼠隨機(jī)血糖值。以后每周監(jiān)測(cè)血糖1次。1.2.5血脂檢測(cè)總膽固醇采用CHO-PAP法,甘油三酯采用GPO-PAP法,高密度脂蛋白與低密度脂蛋白采用清除法。1.2.6血清胰島素和高血糖素的檢測(cè)放免法測(cè)定血清胰島素及胰高血糖素水平,由北京康源瑞得生物技術(shù)有限公司完成。1.2.7空間記憶檢測(cè)能力測(cè)試參考文獻(xiàn),歷時(shí)5d,平臺(tái)固定在SE象限,位于水面下1.5cm,水溫穩(wěn)定在(25±0.5)℃。實(shí)驗(yàn)室中的物品和人員的位置在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中固定不變,作為動(dòng)物的空間參照物。每天測(cè)試2次,每次從不同象限中點(diǎn)將動(dòng)物面向池壁放入水中(入水點(diǎn)采用半隨機(jī)的方法,同一次測(cè)試中所有動(dòng)物的入水點(diǎn)相同),檢測(cè)時(shí)間為120s,在平臺(tái)上停留超過(guò)2s則判定為尋臺(tái)成功,動(dòng)物入水至尋臺(tái)成功時(shí)間為逃避潛伏期,若120s內(nèi)未找到平臺(tái)則潛伏期記為120s。每次測(cè)試前先將動(dòng)物置于平臺(tái)上停留15s,測(cè)試結(jié)束后適應(yīng)10s。計(jì)算每天潛伏期平均值,以評(píng)價(jià)動(dòng)物空間記憶的獲得能力。(2)空間搜索實(shí)驗(yàn)定位航行結(jié)束次日,撤去平臺(tái),選擇NW象限作為入水象限,動(dòng)物在120s內(nèi)穿過(guò)原平臺(tái)位置的次數(shù)評(píng)價(jià)動(dòng)物的空間記憶能力。1.3統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用GraphPadPrism4.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以表示,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2結(jié)果2.1脂大鼠體重變化隨著時(shí)間延長(zhǎng),各組大鼠體重均增加,Ⅲ組(0周STZ30mg/kg+高糖高脂)大鼠體重明顯低于各實(shí)驗(yàn)組,與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;高脂喂養(yǎng)6周后,Ⅴ組、Ⅵ組、Ⅶ組大鼠體重高于對(duì)照組(P<0.05),實(shí)驗(yàn)第7周時(shí)Ⅵ組、Ⅶ組體重較前降低,Ⅶ組降低明顯,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組體重均低于對(duì)照組(圖1,彩插3)。2.2大鼠造模前后血糖指標(biāo)STZ尾靜脈注射72h后觀察大鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀,動(dòng)物萎靡不振,活動(dòng)少;造模后連續(xù)10周動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血糖結(jié)果顯示,Ⅲ組大鼠尾靜脈注射STZ72h后,與對(duì)照組相比,血糖升高明顯(P<0.01),于第2周,升高最為顯著,以后逐漸下降,但仍維持較高水平(P<0.01),STZ注射4周血糖值相對(duì)穩(wěn)定,至觀察第10周,血糖維持在15mmol/L,與對(duì)照組比較,差異有顯著性。Ⅳ組大鼠造模后隨機(jī)血糖值較對(duì)照組升高,造模第2周升高顯著,以后逐漸降低,于第9、10周恢復(fù)正常水平。Ⅴ組、Ⅵ組、Ⅶ組第6周造模后72h檢測(cè),血糖升高明顯,以后逐漸降低,Ⅶ組降低緩慢,仍維持較高水平。Ⅱ組血糖與對(duì)照組比較,無(wú)明顯區(qū)別。以上結(jié)果提示,STZ的劑量,高脂飼料喂養(yǎng)是制備糖尿病模型的重要影響因素(圖2,彩插3)。2.3組療效比較高糖高脂飼料喂養(yǎng)10周后,各組大鼠CHO,TG,LDL-C均增加,其中Ⅲ、Ⅶ組與對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.01);Ⅲ、Ⅶ組大鼠HDL-C低于各實(shí)驗(yàn)組,但差異無(wú)顯著性。以上結(jié)果顯示,高糖高脂飼養(yǎng)與STZ損傷對(duì)血脂異常具有相互促進(jìn)作用。2.4大鼠血清in水平放免法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組大鼠血清胰島素及胰高血糖素水平,結(jié)果顯示,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組大鼠血清INS水平較對(duì)照組增高,但差異無(wú)顯著性。除Ⅳ組外,各組大鼠血清GLU水平均較對(duì)照組增高,其中Ⅱ、Ⅶ組與對(duì)照組比較,差異有顯著性(P<0.05)。2.5糖尿病模型成功組的學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè)定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著時(shí)間延長(zhǎng),各組大鼠發(fā)現(xiàn)平臺(tái)的潛伏期逐漸縮短,與對(duì)照組相比,Ⅱ、Ⅲ組潛伏期較對(duì)照組減少,Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ組潛伏期明顯延長(zhǎng),d4結(jié)果顯示,Ⅶ組與對(duì)照組比較,差異有顯著性;空間搜索實(shí)驗(yàn),各組之間差異無(wú)顯著性,提示造模后高脂喂養(yǎng),與高脂喂養(yǎng)6周后再造模,制備糖尿病模型不同,在一定范圍內(nèi),血糖升高對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力具有促進(jìn)作用。結(jié)合前面血脂結(jié)果,高脂加高糖有降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)習(xí)、記憶能力的趨勢(shì)。3糖尿病模型的建立和運(yùn)行糖尿病是由遺傳與環(huán)境因素共同作用而導(dǎo)致的慢性全身性代謝性疾病。糖尿病動(dòng)物模型的制備是研究其發(fā)病、治療的基礎(chǔ),同時(shí)也是研究的熱點(diǎn)、難點(diǎn)。目前制備糖尿病大鼠模型的方法主要有自發(fā)性動(dòng)物模型、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型和實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型。但前兩者由于培育和飼養(yǎng)條件要求較嚴(yán)格,動(dòng)物價(jià)格昂貴,限制其在科學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用,而實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型因其制備周期短,飼養(yǎng)條件無(wú)特殊要求,成本低,已普遍用于糖尿病的基礎(chǔ)研究。實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠模型的建立主要應(yīng)用鏈脲佐菌素、四氧嘧啶等化學(xué)物質(zhì)損傷胰島β細(xì)胞。其中STZ是一種氨基葡萄糖-亞硝基脲化合物,能夠特異性損傷胰島β細(xì)胞,近年來(lái),常用于糖尿病模型的制備,然而注射劑量,飲食情況對(duì)模型的存活率,成功率及穩(wěn)定性有很大的影響。本文比較不同時(shí)間、劑量STZ尾靜脈注射配合不同飲食制備糖尿病模型,結(jié)果顯示,STZ尾靜脈注射72h后觀察大鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀,動(dòng)物萎靡不振,活動(dòng)少,體重降低等糖尿病典型癥狀;高脂喂養(yǎng)與STZ(劑量大于25mg/kg)注射能夠成功復(fù)制糖尿病模型,單純注射STZ或高脂高糖飲食不能復(fù)制理想的糖尿病模型。已有報(bào)道糖尿病模型多采用腹腔注射方法制備,李楠等研究采用一次性大劑量腹腔注射STZ與高脂高糖飼養(yǎng)配合小劑量STZ兩種方法均建立了DM模型,王春艷研究采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)5周,配合STZ(25mg/kg)腹腔注射2次,制備2型糖尿病模型,盡管實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果大體相當(dāng),然而血糖是動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程,現(xiàn)有報(bào)道多數(shù)實(shí)驗(yàn)未對(duì)血糖做長(zhǎng)期觀察,而本實(shí)驗(yàn)通過(guò)STZ注射后動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血糖的變化,為模型的穩(wěn)定性、進(jìn)一步應(yīng)用模型進(jìn)行藥理實(shí)驗(yàn)確定最佳給藥時(shí)間提供了參考。此外,有研究顯示糖尿病大鼠可出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能的減退,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各高糖高脂飼養(yǎng)組潛伏期較對(duì)照組延長(zhǎng)、穿臺(tái)次數(shù)及平臺(tái)象限停留時(shí)間較對(duì)照組縮短,但差異無(wú)顯著性,可能與血糖高低及檢測(cè)時(shí)間相關(guān),有待于進(jìn)一步驗(yàn)證與深入研究。綜上,本研究通過(guò)動(dòng)態(tài)觀察不同劑量STZ配合不同飲食制備糖尿病模型發(fā)現(xiàn),STZ(30mg/kg)配合高糖高脂膳食能夠快速、穩(wěn)定的建立糖尿病大鼠模型,高糖高脂膳食6周后STZ(30mg/kg)制備模型,血糖升高顯著,血清胰島素水平降低,傾向于1型糖尿病模型,通過(guò)對(duì)DM模型制備方法的探討能夠?yàn)樘悄虿“l(fā)病機(jī)制研究及藥物開發(fā)提供可借鑒的