神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞整體毒性的魚貝類毒素篩查方法

神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞整體毒性的魚貝類毒素篩查方法

赤潮的主要破壞之一是赤潮生物產(chǎn)生的毒素通過鏈和循環(huán)傳遞，對人類的健康和安全有嚴(yán)重威脅。根據(jù)人們中毒后的癥狀和染毒媒介,可將赤潮毒素分為麻痹性貝毒(paralyticshellfishpoisoningtoxin,PST)、腹瀉性貝毒(diarrheticshellfishpoisoningtoxin,DST)、記憶缺失性貝毒(amnesicshellfishpoisoningtoxin,AST)和神經(jīng)性貝毒(neurotoxicshellfishpoisoningtoxin,NST)等。河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)雖然與赤潮的發(fā)生無關(guān),但作用機(jī)制與PST相似,經(jīng)常引起人類中毒。PST是一類四氫嘌呤毒素,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)20多種。根據(jù)取代基團(tuán)的差異,可以將其分為4類:氨基甲酸酯類毒素(carbamatetoxins),包括石房蛤毒素(saxitoxin,STX)、新石房蛤毒素(neoSTX)和膝溝藻毒素1-4(gonyautoxins,GTX1-4);N-磺酰氨甲?；惗舅?N-sulfocarbamoyltoxins),包括B1-2和C1-4;脫氨甲?；惗舅?decarbamoyltoxins),包括dcSTX、dcneoSTX和dcGTX1-4;脫氧脫氨甲?；惗舅?deoxydecarbamoyltoxins),包括doSTX和doGTX2,3等。目前研究最多的是STX和GTX1-4。PST與細(xì)胞膜上電壓門控Na+通道位點(diǎn)的氨基酸殘基高度親和,可選擇性阻斷Na+內(nèi)流,從而抑制動作電位的形成,造成神經(jīng)系統(tǒng)傳輸障礙。中毒后可造成面部及肢端麻木、暈眩、惡心、嘔吐等,嚴(yán)重的會因呼吸肌麻痹而導(dǎo)致死亡。TTX的致毒機(jī)制與PST相似,也可通過阻斷電壓依賴性Na+通道引起機(jī)體中毒。NST也叫做短裸甲藻毒素(brevetoxins,BTX),可特異結(jié)合電壓敏感的Na+通道,使Na+通道激活,引致Na+內(nèi)流,造成細(xì)胞膜去極化,產(chǎn)生以胃腸道和神經(jīng)癥狀為主的中毒癥狀。利用電壓敏感染料(voltagesensitivedye)光學(xué)記錄膜電位是電生理研究中的一項嶄新技術(shù)。本實驗室曾利用該方法建立了GTX2,3熒光染料檢測方法,測定結(jié)果與小鼠法非常吻合。本研究在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步觀察了電壓敏感熒光染料孵育神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞后,GTX2,3、TTX和BTX等3種毒素對培養(yǎng)體系熒光強(qiáng)度的影響。1材料和方法1.1其它試劑和儀器F-4500熒光分光光度計(日本Hitachi),CO2培養(yǎng)箱(美國Themro),倒置相差顯微鏡(日本Olympus)。DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基(杭州吉諾公司);胎牛血清(杭州四季青公司);胰蛋白酶(上海生工);bis-oxonol、藜蘆定(veratridine)和短桿菌肽(gramicidin)購于Sigma公司,GTX2,3(生化試劑,NRC,Canada),河豚毒素TTX(生化試劑,GuangzhouSwellxinScienceandTechnologyLo.Ltd),神經(jīng)毒素BTX(生化試劑,Sigma公司);其它試劑均為分析純。神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SK-N-SH)購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。1.2細(xì)胞培養(yǎng)將購買的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至25cm2培養(yǎng)瓶中,加入含15%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基,于5%CO2、37℃、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1~2天換一次液,待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時,用0.25%胰蛋白酶消化傳代備用。1.3btx的熒光強(qiáng)度測定熒光測定參照LOUZAO的方法。取濃度為2.5×105cells/ml的備用細(xì)胞懸液加入至1ml比色杯中,依次加入終濃度為4nmol/Lbis-oxonol、40μmol/L藜蘆定和一定濃度梯度的GTX2,3和TTX。對BTX來說,加入bis-oxonol后,待熒光強(qiáng)度穩(wěn)定,直接加入BTX標(biāo)準(zhǔn)品,不加藜蘆定。GTX2,3的終濃度分別為2、60、80、100、160和200ng/ml;TTX的終濃度分別為20、80、100、200、400和600ng/ml;BTX的終濃度分別為15、60、100、200、300和400ng/ml。最后加入10μg/ml短桿菌肽。對照組加入溶解毒素所用的溶劑。于激發(fā)波長530nm,發(fā)射波長560nm,狹縫5.0nm,流速1200nm/min條件下測定熒光。計算GTX2,3和TTX對熒光強(qiáng)度的抑制率,BTX對熒光強(qiáng)度的激活率,繪制抑制率或激活率與毒素濃度間的關(guān)系曲線。計算公式為:抑制率=(F0-FT)/(F0-Fb)×100%;激活率=(FT-Fb)/Fb×100%式中:F0為單純加入藜蘆定后的熒光強(qiáng)度;FT為加入毒素后的熒光強(qiáng)度;Fb為對照組加入bis-oxonol后的熒光強(qiáng)度。1.4毒素濃度與熒光強(qiáng)度的關(guān)系每種毒素濃度的熒光強(qiáng)度測定3次,結(jié)果用Excel計算取平均值,數(shù)據(jù)用表示。然后以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo),時間為橫坐標(biāo)繪制毒素濃度與熒光強(qiáng)度變化關(guān)系曲線;計算抑制率或激活率,抑制率或激活率為縱坐標(biāo),毒素濃度為橫坐標(biāo),繪制抑制率或激活率與毒素濃度的關(guān)系曲線。2結(jié)果2.1btx用量對鈉通道激活劑提取效果的影響由圖1~2可見,加入bis-oxonol后細(xì)胞熒光強(qiáng)度變化不大。加入藜蘆定后,熒光強(qiáng)度顯著增加。加入不同濃度毒素后,熒光強(qiáng)度迅速降低,其變化與毒素濃度之間存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系,最后加入使細(xì)胞完全去極化的短桿菌肽,熒光強(qiáng)度再次升高。由圖3可見,BTX是鈉通道激活劑,反應(yīng)體系加入BTX后,熒光強(qiáng)度的變化隨BTX濃度升高而增強(qiáng),當(dāng)濃度為400ng/ml時,熒光強(qiáng)度達(dá)到最高,熒光強(qiáng)度變化與毒素濃度之間呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。最后加入使細(xì)胞完全去極化的短桿菌肽,熒光強(qiáng)度再次升高。2.2抑制率與毒素濃度的關(guān)系由圖4、圖5可見,GTX2,3濃度在2~200ng/ml,TTX濃度在20~600ng/ml之間時,抑制率與毒素的濃度呈明顯的線性關(guān)系。由圖6可見,BTX濃度在15~400ng/ml范圍內(nèi),隨著濃度增加,激活率也相應(yīng)增強(qiáng),激活率與濃度之間有很好的線性對應(yīng)關(guān)系(R2=0.9358)。3與na+通道相互影響的染色目前,貝類毒素的檢測技術(shù)主要有小鼠法、高效液相色譜法、免疫檢測技術(shù)和細(xì)胞毒性測定法等。小鼠法存在測定結(jié)果誤差大、重現(xiàn)性低、假陽性高的缺點(diǎn),高效液相色譜法則受標(biāo)準(zhǔn)品的限制,可能會出現(xiàn)新毒素漏檢的問題。bis-oxonol是一種電壓敏感熒光染料,其在細(xì)胞內(nèi)外的分布依賴細(xì)胞的膜電位。實驗結(jié)果顯示,培養(yǎng)體系中加入bis-oxonol后細(xì)胞熒光強(qiáng)度變化不大。加入藜蘆定后,熒光強(qiáng)度顯著增加。藜蘆定是存在于藜蘆屬生物堿中的一種類固醇類化合物,可與Na+通道結(jié)合,使鈉通道開放,bisoxonol染料就會流向細(xì)胞膜表面,從而導(dǎo)致細(xì)胞熒光強(qiáng)度增加。加入不同濃度GTX2,3、TTX后,Na+通道被阻斷,細(xì)胞去極化程度受到抑制,bisoxonol又會流向細(xì)胞內(nèi),熒光強(qiáng)度隨之降低,其變化與毒素濃度之間存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。其中,GTX2,3的濃度在2~200ng/ml范圍內(nèi),TTX的濃度在20~600ng/ml范圍內(nèi),熒光強(qiáng)度的抑制率與GTX的濃度呈明顯的線性關(guān)系。加入bis-oxonol后直接加入BTX時,由于BTX可激活Na+通道,使細(xì)胞去極化增強(qiáng),熒光強(qiáng)度隨BTX濃度的增加而增強(qiáng),在15~400ng/ml范圍內(nèi),熒光強(qiáng)度的激活率與濃度有很好的線性關(guān)系。這些結(jié)果表明,利用熒光染料bis-oxonol,以神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞為熒光載體,通過GTX2,3、TTX和BTX等毒素與培養(yǎng)體系熒光強(qiáng)度的關(guān)系曲線可實現(xiàn)對毒素的定量測定。由于熒光強(qiáng)度的變化是因為毒素對細(xì)胞Na+通道的特異性阻斷或激活引起的,因此可有效反