非甲基化cpg的c區(qū)域引物的設(shè)計(jì)

非甲基化cpg的c區(qū)域引物的設(shè)計(jì)

由于需要充分軟化dna，我們必須選擇包含盡可能多非甲基化cpg的“c”區(qū)域作為源序列，并選擇引用對(duì)象。對(duì)于BSP,引物設(shè)計(jì)的原則:①為了區(qū)別甲基化DNA和非甲基化DNA,引物不應(yīng)含有CpG位點(diǎn);②引物擴(kuò)增的產(chǎn)物應(yīng)包含盡可能多的CpG位點(diǎn)。1.4pcr檢測(cè)dna甲基化對(duì)于MSP需要設(shè)計(jì)2對(duì)引物,一對(duì)是針對(duì)于經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的甲基化的DNA;另一對(duì)是針對(duì)于經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的非甲基化的DNA。根據(jù)甲基化的DNA為模板的PCR擴(kuò)增甲基化的DNA;根據(jù)非甲基化的DNA為模板的PCR擴(kuò)增非甲基化的DNA。MSP引物設(shè)計(jì)的原則:①為了最大限度的區(qū)分甲基化與非甲基化,引物的3′端至少包含1個(gè)CpG位點(diǎn),我們可以自己設(shè)定CpG的“C”距3′末端的最遠(yuǎn)距離?！癕ethPrimer”中默認(rèn)值為3,即是在引物的最后3個(gè)堿基中,至少有1個(gè)是CpG的“C”。②引物序列中應(yīng)包含盡可能多的CpG位點(diǎn)。③甲基化引物和非甲基化引物序列3′端應(yīng)處于相同的CpG位點(diǎn)。如果,2對(duì)引物不在相同的CpG位點(diǎn)退火,PCR結(jié)果就不能準(zhǔn)確反映樣本DNA甲基化的情況。但是甲基化引物和非甲基化引物可跨越不同的長(zhǎng)度,在起始位點(diǎn)和長(zhǎng)度上也可以不同。一般非甲基化引物比甲基化引物長(zhǎng),因?yàn)槭躎m值限制,由于非甲基化引物中的“C”轉(zhuǎn)化成“T”,導(dǎo)致GC含量降低,從而引起Tm降低。④2套引物應(yīng)有相近的Tm值,“MethPrimer”中默認(rèn)2套引物Tm值相差不超過5℃,這種限制可使2個(gè)PCR反應(yīng)在同一PCR儀中進(jìn)行。2結(jié)果2.1bfs索引來自methprote設(shè)計(jì)的bps索引2.2引物的選擇及pcr輸入ERβ啟動(dòng)子序列,選擇“PickMSPprimers”,其他參數(shù)選擇程序默認(rèn)值,點(diǎn)擊“Submit”,“MethPrimer”軟件即可顯示預(yù)測(cè)的ERβ啟動(dòng)子序列的CpG島,及引物的相應(yīng)位置,同時(shí)也顯示設(shè)計(jì)的MSP引物,有5組引物,每組分別有甲基化引物、非甲基化引物,我們可選擇1組引物進(jìn)行PCR(表2),通常情況下選擇第1組引物,進(jìn)行PCR,如果所選擇的引物PCR效果不佳,可選擇其他幾組引物,也可優(yōu)化PCR反應(yīng)條件,或者是更改MSP引物設(shè)計(jì)參數(shù),重新設(shè)計(jì)引物。3設(shè)計(jì)引物的密度引物的成功設(shè)計(jì)對(duì)于PCR是至關(guān)重要的,硫化反應(yīng)促使DNA鏈中的“C”轉(zhuǎn)化為“U”,導(dǎo)致GC含量降低,使PCR反應(yīng)后在序列中出現(xiàn)長(zhǎng)的連續(xù)“T”,容易引起DNA鏈的斷裂。此外,純化過程中的DNA的丟失,也是要考慮的另一個(gè)因素,這些因素又會(huì)影響下面的PCR的進(jìn)行,這些都是設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)需要考慮的。一般情況下,PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度大于300bp時(shí),就很難以硫化DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。因此,“MethPrimer”程序設(shè)計(jì)PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度在100～300bp,200bp的長(zhǎng)度比較合適。與標(biāo)準(zhǔn)PCR不同的是甲基化PCR引物的長(zhǎng)度,甲基化PCR一般需要更長(zhǎng)的引物,引物長(zhǎng)度在30bp左右,原因是硫化降低了模板DNA的GC含量,使序列中出現(xiàn)長(zhǎng)的連續(xù)“T”,導(dǎo)致很難選擇具有合適的Tm值及穩(wěn)定的引物;另一方面,為了區(qū)別硫化處理和沒有硫化處理以及未完全處理的DNA,需要引物有足夠數(shù)量的“C”,這些都增加了選擇穩(wěn)定引物的困難。因此,為了獲得更穩(wěn)定的雙鏈,選擇更長(zhǎng)的引物是有必要的,因?yàn)镈NA的Tm值取決于引物的長(zhǎng)度。一般情況下,甲基化PCR引物的長(zhǎng)度在20～30bp。“MethPrimer”默認(rèn)的引物長(zhǎng)度在20～30bp,25bp為最適長(zhǎng)度?！癕ethPrimer”在設(shè)計(jì)引物時(shí),不考慮輸入序列中的重復(fù)元件和載體序列。因?yàn)?對(duì)于DNA甲基化的研究,我們一般注重有特點(diǎn)的序列或者序列中確定的區(qū)域,大部分這些序列或區(qū)域是啟動(dòng)子序列,因此載體序列不考慮;另一方面,輸入的序列由程序模擬硫化處理發(fā)生了轉(zhuǎn)化,這樣重復(fù)的元件不再重復(fù)了,即使是引物位置所在的序列在轉(zhuǎn)化前是重復(fù)序列,也不會(huì)影響引物的質(zhì)量。總之,“MethPrimer”是一個(gè)特異性的針對(duì)硫化PCRs(BSP和MSP)設(shè)計(jì)引物的程序,其操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確,對(duì)于研究DNA甲基化是一個(gè)至關(guān)重要的工具。目前,“MethPrimer”正在進(jìn)一步地發(fā)展和完善,使它可以設(shè)計(jì)出更多其他的硫化PCRs的引物。DNA甲基化是哺乳類動(dòng)物一個(gè)重要的基因外遺傳信號(hào)。有研究表明,DNA甲基化與大多數(shù)腫瘤的發(fā)生相關(guān),抑癌基因啟動(dòng)子CpG島的高甲基化可引起抑癌基因表達(dá)沉默,細(xì)胞出現(xiàn)無節(jié)制生長(zhǎng),導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。目前,甲基化特異性PCR(methylation-specificPCR,MS-PCR)是研究DNA甲基化最為常用且準(zhǔn)確度較高的方法之一,而理想的引物設(shè)計(jì)則是其成功的關(guān)鍵因素之一。國(guó)外互聯(lián)網(wǎng)上有1個(gè)提供免費(fèi)在線引物設(shè)計(jì)程序“MethPrimer”,它能夠預(yù)測(cè)CpG島,根據(jù)實(shí)驗(yàn)者要求設(shè)計(jì)硫化測(cè)序PCR(bisulfate-sequencingPCR,BSP)和甲基化特異性PCR(methylation-specificPCR,MSP)引物。本研究旨在介紹甲基化特異性PCR引物設(shè)計(jì)的原則及“MethPrimer”設(shè)計(jì)程序的使用方法和有關(guān)注意事項(xiàng)。1材料和方法1.1引物的輸入程序DNA經(jīng)亞硫酸氫鹽硫化處理后,DNA雙鏈中的“C”轉(zhuǎn)化為“U”,通過隨后的PCR,將“U”轉(zhuǎn)化為“T”,但亞硫酸氫鹽不能使已發(fā)生了甲基化的DNA的“C”發(fā)生上述轉(zhuǎn)化,因此,根據(jù)經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA模板設(shè)計(jì)引物時(shí),先輸入感興趣的DNA序列,程序?qū)?huì)顯示2種序列:一種是輸入的源DNA序列;另一種是硫化處理后的DNA序列,除了CpG島上的5甲基胞嘧啶(5mC)之外,所有非甲基化的“C”都轉(zhuǎn)換成了“T”,根據(jù)轉(zhuǎn)化后的序列設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行BSP和MSP。1.2cpg的聚集哺乳類動(dòng)物基因組中5%~10%是CpG(二核苷酸),其中70%~80%呈甲基化狀態(tài),稱為甲基化的CpG(mCpG)。CpG的聚集稱CpG島,已知在所有管家基因和一些組織特異基因的5′端調(diào)控區(qū)均有CpG島呈高度甲基化,基因組中平均100個(gè)bp有1個(gè)跨度為0.5~5kb的CpG島?！癕ethPrimer”設(shè)計(jì)程序默認(rèn)的CpG島跨度至少為200bp,GC含量>50%,CpG出現(xiàn)頻率>0.6。因此,符合這些參數(shù)的區(qū)域都默認(rèn)為CpG島,我們根據(jù)任意1個(gè)CpG島設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。1.3“methprityr”的應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的PCR引物設(shè)計(jì)原則同樣適用于硫化測(cè)序PCR(bisulfitesequencingPCR,BSP),除了標(biāo)準(zhǔn)PCR的一些參數(shù)外,“MethPrimer”