耳甲區(qū)電刺激對CUMS模型大鼠抗抑郁效應及ERK信號通路作用機制

耳甲區(qū)電刺激對CUMS模型大鼠抗抑郁效應及ERK信號通路作用機制抑郁癥是一個全球性的精神衛(wèi)生問題,它以心境低落為主要特征,伴有認知功能損害,具有高患病率、高復發(fā)率、高自殺率的特點,對人類健康、生活和工作造成嚴重危害。根據(jù)世界衛(wèi)生組織預測,截至2020年,在影響人類健康、增加社會負擔的疾患中,抑郁癥將可能躍居全球第二位,造成不同程度的社會財政負擔的增加。但迄今為止,對抑郁癥病因的認識仍尚未明了。從中醫(yī)角度來看,雖古代文獻并未出現(xiàn)明確的“抑郁癥”病名,但歸屬于“郁證”的范疇,發(fā)病內(nèi)因多為臟氣虛弱,并常常由情志不遂所誘發(fā),以肝郁脾虛、心神失養(yǎng)為主要病機;從西醫(yī)發(fā)病機制角度來看,單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說和神經(jīng)遞質(zhì)受體假說是目前最主要和最經(jīng)典的假說,而神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)功能失調(diào)、神經(jīng)可塑性失調(diào)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子功能失調(diào)、神經(jīng)免疫功能失調(diào)、信號轉(zhuǎn)導通路失調(diào)等假說的出現(xiàn),也逐漸豐富了人們對抑郁癥病理機制的理解。關(guān)于抑郁癥的治療,臨床使用仍然以抗抑郁藥物治療為主(包括三環(huán)類抗抑郁藥、單胺氧化酶抑制劑、選擇性5-HT再攝取抑制劑等),這些抗抑郁藥均存在起效慢(需時2-3周)的缺點,和胃腸道反應、頭痛、嗜睡或者失眠、性功能障礙等不良反應,但最大缺點是不能及時防范和治療早期重癥抑郁癥患者的自殺風險,且大約1/3到2/3患者對初次選用的抗抑郁藥無反應。非藥物療法主要包括心理療法和物理療法,其中認知行為療法(CognitiveBehavioralTherapy,CBT)被認為是較為有效的治療抑郁癥的心理治療方法之一,但其耗時較長,僅能作為藥物的輔助治療方法。迷走神經(jīng)刺激(VagusNerveStimulation,VNS)療法作為較為常見的一種物理療法,于2005年7月正式由美國FDA批準用于難治性抑郁癥的治療,然而,這種外科手術(shù)不但費用昂貴、有術(shù)后感染風險,且在10周治療后有效率僅達40%?；谏窠?jīng)解剖學研究顯示,耳區(qū)特定部位(如耳甲腔和后耳下方乳突上)具有豐富的迷走神經(jīng)分布,我們課題組多年來致力于經(jīng)皮耳甲迷走神經(jīng)刺激(TranscutaneousAuricularVagusNerveStimulation,taVNS)治療抑郁癥的研究,結(jié)果顯示taVNS可有效緩解抑郁癥患者的抑郁/焦慮癥狀,顯著降低漢密爾頓抑郁量表和焦慮量表得分,不僅產(chǎn)生了與VNS相類似的臨床療效,而且有效的克服了有創(chuàng)VNS應用所帶來的上述缺陷。taVNS療法雖然尚處于早期探索及研發(fā)階段,但其在抑郁癥治療的臨床科研和實踐中已經(jīng)發(fā)揮了備受眾人矚目的重要作用。值得一提的是,常用于治療抑郁癥的耳穴恰好也位于耳迷走神經(jīng)分布的區(qū)域,因此,我們認為耳針和taVNS在某種程度上是在不同理論指導下的相同或相似的診療過程。然而,taVNS治療抑郁癥特定頻率的選擇尚未得到有效評估,且其良好的抗抑郁效應機制也尚未闡明,因此本研究在上述臨床和實驗的基礎(chǔ)之上,試圖比較5Hz、20Hz、100Hz三個不同頻率taVNS對慢性不可預知性刺激(ChronicUnpredictableMildStress,CUMS)誘導的抑郁模型大鼠行為學(包括糖水偏好實驗、強迫游泳實驗和曠場實驗)、下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(HypothalamicPituitaryAdrenal,HPA)功能(包括血漿皮質(zhì)酮、促腎上腺皮質(zhì)激素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素)的影響,從行為學和HPA軸功能狀態(tài)兩個角度評估taVNS抗抑郁效應的優(yōu)選頻率。另一方面,海馬體積的縮小是抑郁癥發(fā)病主要的腦結(jié)構(gòu)改變,細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ExtracellularSignal-RegulatedKinase,ERK)信號轉(zhuǎn)導通路的正常功能狀態(tài)與神經(jīng)元的生長、分化、凋亡和增殖密切相關(guān),因此本研究通過探討ERK通路上、下游蛋白的表達,試圖進一步闡釋taVNS抗抑郁作用的效應機制。方法實驗一不同頻率耳甲區(qū)電刺激對CUMS抑郁模型大鼠行為學的影響50只健康雄性成年SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠,由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供[許可證號:SCXK(京)2014-0013],體重為200±20g。將大鼠隨機分為空白組(n=10)、模型組(n=10)、5Hz-taVNS組(n=10)、20Hz-taVNS組(n=10)、100Hz-taVNS組(n=10)。所有大鼠均適應性喂養(yǎng)一周。本實驗采用孤養(yǎng)結(jié)合7種慢性不可預知性應激刺激的方法,包括:禁水(24小時)、禁食(24小時)、晝夜顛倒(12/12小時)、冰水游泳(0℃,5分鐘)、潮濕墊料(24小時)、夾尾(1分鐘)、熱板(52℃,5分鐘),造模時間為21天。每天選取其中一種應激刺激方法,平均每種刺激方式使用2-3次,并且每種刺激不能連續(xù)兩天發(fā)生,以免大鼠對應激刺激產(chǎn)生預見性。耳甲區(qū)電刺激是在2%異氟烷吸入麻醉下進行,采用華佗牌電子針療儀,連接正負自吸附導電磁鐵,經(jīng)皮無創(chuàng)固定于大鼠雙側(cè)耳甲腔部,對大鼠進行電刺激干預。作用時間為每天上午9:00-12:00,每天刺激30分鐘,頻率為5Hz或20Hz或100Hz連續(xù)波,刺激強度為2mA,共持續(xù)28天。分別于造模前(第-21天)、造模第1(第-14天)、2(第-7天)、3(第0天)周、電刺激的第1(第7天)、2(第14天)、3(第21天)、4(第28天)周檢測一次糖水偏好量、強迫游泳不動時間和曠場實驗水平運動和垂直運動得分,以評估各組大鼠的抑郁樣行為。實驗二不同頻率耳甲區(qū)電刺激對CUMS抑郁模型大鼠HPA軸功能的影響本研究采用21天CUMS方法制作抑郁癥模型,并對模型大鼠進行28天不同頻率耳甲區(qū)電刺激。分組情況、造模及干預方法同實驗一。實驗結(jié)束后,采用Elisa法檢測比較各組大鼠血漿皮質(zhì)酮(CORT)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)以及促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRF)含量,評價不同頻率耳甲區(qū)電刺激對CUMS抑郁模型大鼠HPA軸功能的影響。實驗三耳甲區(qū)電刺激對CUMS大鼠海馬內(nèi)ERK信號轉(zhuǎn)導通路的影響30只SD大鼠隨機分為空白組(n=5)、模型組(n=5)、taVNS組(n=5)、模型/PD98059組(n=5)、模型/DMSO組(n=5)、模型/PD98059/taVNS組(n=5)。采用21天CUMS方法制作抑郁癥模型(造模方法同實驗一),側(cè)腦室注射ERK信號通路阻斷劑PD98059或有機溶劑DMSO,taVNS持續(xù)干預28天。實驗結(jié)束后處死動物,取各組大鼠海馬組織,使用Westernblot方法檢測Raf、p-Raf、ERK、p-ERK、RSK、CREB、p-CREB蛋白表達水平,探討taVNS對抑郁模型大鼠海馬ERK信號轉(zhuǎn)導通路的影響,探索taVNS抗抑郁效應的作用機制和作用靶點。結(jié)果實驗一不同頻率耳甲區(qū)電刺激對CUMS抑郁模型大鼠行為學的影響1.不同頻率耳甲區(qū)電刺激對CUMS抑郁模型大鼠糖水偏好的影響結(jié)果顯示,實驗開始前(第-21天)各組大鼠糖水偏好未見明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05),組間具有可比性。從造模第-14天到第0天,模型組、5Hz-taVNS組、20Hz-taVNS組和100Hz-taVNS組比空白組大鼠糖水偏好明顯下降(P<0.01),顯示造模成功;電刺激第21天和第28天,20Hz-taVNS組大鼠與模型組相比,糖水偏好量均明顯升高(P<0.01,P<0.05),而5Hz-taVNS和100Hz-taVNS與模型組相比未見明顯差異(P>0.05)。2.不同頻率耳甲區(qū)電刺激對CUMS抑郁模型大鼠強迫游泳不動時間的影響結(jié)果顯示,實驗開始前(第-21天)各組大鼠強迫游泳不動時間未見明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05),具有組間可比性。從造模第-14天到第0天,與空白組相比,模型組、5Hz-taVNS、20Hz-taVNS和1OOHz-taVNS組大鼠強迫游泳不動時間明顯升高(P<0.01),表現(xiàn)出明顯的抑郁樣行為;電刺激第28天,20Hz-taVNS組大鼠強迫游泳不動時間與模型組比較明顯下降(P<0.05),5Hz-taVNS和100Hz-taVNS與模型組相比未見明顯差異(P>0.05)。3.不同頻率耳甲區(qū)電刺激對CUMS抑郁模型大鼠曠場實驗得分的影響結(jié)果顯示,實驗開始前(第-21天)各組大鼠曠場實驗水平運動和垂直運動得分均未見明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05),組間具有可比性。從造模第-14天到第0天,模型組、5Hz-taVNS、20Hz-taVNS和100Hz-taVNS組大鼠與空白組相比水平運動和垂直運動得分均明顯下降(P<0.01),表現(xiàn)出明顯的抑郁樣行為;電刺激第21天,20Hz-taVNS組大鼠水平運動得分明顯高于模型組(P<0.05),垂直運動得分沒有明顯變化(P>0.05);電刺激第28天,20Hz-taVNS組大鼠水平運動和垂直運動得分均明顯升高(P<0.01),而5Hz-taVNS和100Hz-taVNS與模型組相比未見明顯差異(P>0.05)。實驗二不同頻率耳甲區(qū)電刺激對CUMS抑郁大鼠HPA軸功能的影響結(jié)果顯示,與空白組大鼠相比,抑郁模型組大鼠CORT、ACTH含量明顯升高(P<0.01,P<0.01),20Hz-taVNS組與模型組相比二者明顯降低(P<0.01,P<0.01),而5Hz-taVNS和100Hz-taVNS組與模型組比較均未見明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)。關(guān)于血漿CRF含量,各組間比較均未見明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05),但模型組與空白組相比,CRF含量呈現(xiàn)出升高趨勢,且20Hz-taVNS組大鼠血漿CRF與空白組含量相當。實驗三耳甲區(qū)電刺激對CUMS抑郁模型大鼠海馬內(nèi)ERK信號轉(zhuǎn)導通路的影響1.不同時間點各組大鼠糖水偏好量比較結(jié)果顯示,實驗開始前(第-21天)各組大鼠糖水偏好量未見明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05),具有組間可比性。連續(xù)21天CUMS誘導后(第0天),與空白組比較,模型組、M/taVNS組、M/PD組、M/DMSO組、M/PD/taVNS組大鼠糖水偏好量均明顯下降(P<0.01),表明抑郁模型制作成功。各組大鼠經(jīng)過不同干預處理后(第28天),與空白組比較,模型組、M/PD組、M/DMSO組和M/PD/taVNS組均明顯下降(P<0.01),而M/taVNS組未見明顯差異(P>0.05);與模型組比較,僅M/taVNS組明顯升高(P<0.05),其余各組均無差異(P>0.05);與M/taVNS組比較,M/PD組、M/DMSO組和M/PD/taVNS組均明顯下降(P<0.05、P<0.05、P<0.01),且與模型組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。2.各組大鼠海馬區(qū)Raf和p-Raf蛋白的表達實驗結(jié)束后(第28天)處死大鼠,取海馬組織,使用Westernblot方法檢測Raf和p-Raf蛋白的表達。Raf蛋白表達:與空白組比較,模型組、M/PD組、M/DMSO組、M/PD/taVNS組均明顯下降(P<0.01、P<0.01、P<0.01、P<0.05),而M/taVNS組無統(tǒng)計學差異(P>0.05);與模型組比較,M/taVNS組和M/PD/taVNS組均明顯升高(P<0.05、p<0.05);與M/taVNS組比較,M/PD組和M/DMSO組均明顯下降(P<0.05、P<0.05),而其余各組未見顯著性差異(P>0.05)。p-Raf蛋白表達:與空白組比較,模型組、M/PD組、M/DMSO組均明顯下降(P<0.01、P<0.01、P<0.01);與模型組比較,M/taVNS組和M/PD/taVNS組均明顯升高(P<0.01、P<0.01);與M/taVNS組比較,M/PD組和M/DMSO組均明顯下降(P<0.01、P<0.01),其余各組均未見明顯差異(P>0.05)。3.各組大鼠海馬區(qū)ERK和p-ERK蛋白表達比較實驗結(jié)束后(第28天)處死大鼠,使用Westernblot方法檢測各組大鼠海馬區(qū)ERK和p-ERK蛋白的表達。ERK蛋白表達:與空白組比較,模型組、M/PD組和M/DMSO組均明顯下降(P<0.01、P<0.01、P<0.01);與模型組比較,M/taVNS組和M/PD/taVNS組均明顯升高(P<0.05、P<0.05);與M/taVNS組比較,M/DMSO組明顯下降(P<0.05),其余各組未見顯著性差異(P>0.05)。p-ERK蛋白表達:與空白組比較,模型組、M/PD組、M/DMSO組和M/PD/taVNS組均明顯下降(P<0.01、P<0.01、P<0.01、P<0.01);與模型組比較,M/taVNS組明顯升高(P<0.01),而M/PD組明顯下降(P<0.05);與M/taVNS組比較,M/PD組、M/DMSO組和M/PD/taVNS組均明顯下降(P<0.01、P<0.01、P<0.05),其余各組均未見顯著性差異(P>0.05)。4.各組大鼠海馬區(qū)Rsk蛋白表達比較實驗結(jié)束后(第28天)處死大鼠,取各組大鼠海馬組織,使用Westernblot方法檢測Rsk蛋白的表達情況。結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組、M/PD組、M/DMSO組和M/PD/taVNS組均明顯下降(P<0.01、P<0.01、P<0.01、P<0.01);與模型組比較,M/taVNS組明顯升高(P<0.01);與M/taVNS組比較,M/PD組、M/DMSO組和M/PD/taVNS組均明顯下降(P<0.05、P<0.05、P<0.01),其余各組未見顯著性差異(P>0.05)。5.各組大鼠海馬區(qū)CREB和p-CREB蛋白表達比較實驗結(jié)束后(第28天)處死大鼠,使用Westernblot方法檢測各組大鼠海馬區(qū)CREB和p-CREB蛋白的表達。CREB蛋白表達:與空白組比較,模型組、M/PD組、M/DMSO組和M/PD/taVNS組均明顯下降(P<0.01、P<0.01、P<0.01、P<0.01);與模型組比較,M/taVNS組和M/PD/taVNS組均明顯升高(P