酶工程復習資料

/第一章緒論★1、酶與酶工程定義酶：具有生物催化功能的生物大分子。酶工程：酶的生產與應用的技術過程。★2、酶的分類與命名原則（圖見書P3酶的分類）一、蛋白類酶的分類與命名1、習慣命名法1961年以前使用的酶的名稱都是習慣沿用的，稱為習慣名。主要依據原則：（1）根據酶作用的底物命名；淀粉酶、蛋白酶（2）根據酶催化反應的性質及類型命名；有的酶結合上述兩個原則來命名。脫氫酶、谷丙轉氨酶（3）來源：胃蛋白酶、木瓜蛋白酶習慣命名比較簡單，應用歷史較長，盡管缺乏系統(tǒng)性，但現(xiàn)在還被人們使用。2、國際系統(tǒng)命名法國際系統(tǒng)命名法原則是以酶的整體反應為基礎的，規(guī)定每種酶的名稱應當明確標明酶的底物及催化反應的性質。如果一種酶催化兩個底物起反應，應在它們系統(tǒng)名稱中包括兩個底物的名稱，并以“：”號將它們隔開。若底物之一是水時，可將水略去不寫。3、國際系統(tǒng)分類法及酶的編號1961年國際酶學委員會（EnzymeCommission,EC）根據酶所催化的反應類型和機理，把酶分成6大類：氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂合酶、異構酶、合成酶，分別用1、2、3、4、5、6表示。每一個酶的分類編號由4個數(shù)字組成，數(shù)字間由“·”隔開，編號之前冠以EC（EnzymeCommission)。乳酸脫氫酶EC1.1.1.27第1大類，氧化還原酶第1亞類，氧化基團CHOH第1亞亞類，H受體為NAD+該酶在亞亞類中的流水編號(1)氧化-還原酶氧化-還原酶催化氧化-還原反應。主要包括脫氫酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如乳酸脫氫酶苯丙氨酸氧化酶，催化苯丙氨酸→酪氨酸。如兒童缺乏苯丙氨酸氧化酶，則苯丙氨酸→苯丙酮酸。苯丙酮酸隨血液進入大腦，損害大腦發(fā)育，兒童稱為弱智——苯丙酮尿癥。(2)轉移酶轉移酶催化基團轉移反應，即將一個底物分子的基團或原子轉移到另一個底物的分子上。

例如，谷丙轉氨酶催化的氨基轉移反應。(3)水解酶水解酶催化底物的加水分解反應。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反應：(4)裂合酶裂合酶催化從底物分子中移去一個基團或原子形成雙鍵的反應及其逆反應。主要包括醛縮酶、水化酶及脫氨酶等。例如，延胡索酸水合酶催化的反應。(5)異構酶異構酶催化各種同分異構體的相互轉化，即底物分子內基團或原子的重排過程。

例如，6-磷酸葡萄糖異構酶催化的反應。(6)合成酶合成酶，又稱為連接酶，能夠催化C-C、C-O、C-N以及C-S鍵的形成反應。這類反應必須與ATP分解反應相互偶聯(lián)。A+B+ATP+H-O-H===A?B+ADP+Pi例如，丙酮酸羧化酶催化的反應。丙酮酸+CO2?草酰乙酸二、核酸類酶的分類與命名1、分子內催化R酶：催化本身RNA分子的核酸類酶★自我剪切型：在一定條件下催化本身RNA分子進行剪切反應的R酶。RNA前體→成熟的RNA+RNA片段例：T4噬菌體前體、丁型肝炎病毒RNA前體等?！镒晕壹艚有停涸谝欢l件下催化本身RNA分子進行剪切和連接反應的R酶。含Ⅰ型IVS的R酶：與四膜蟲rRNA前體的IVS結構相似，催化自我剪接需鳥苷（或5′鳥苷酸）和Mg2+參與。含Ⅱ型IVS的R酶：與細胞核mRNA前體中的IVS相似，催化自我剪接反應不需要鳥苷或鳥苷酸參與，但仍需Mg2+。2、分子間催化R酶催化其他分子進行反應的核酸類酶。RNA剪切酶、DNA剪切酶、多肽剪切酶、多糖剪接酶、多功能R酶酶活力概念酶活力的大小可以用一定條件下酶所催化的反應初速度表示。在外界條件相同的情況下，反應初速度越大，意味著酶活力越高。固定化酶活力的常用測定方法及注意點（P10見書上）第二章酶生物合成的基本理論★酶的生產方法1、提取分離法定義：采用各種技術從動植物或微生物細胞中將酶提取出來，再與所含雜質進行分離的技術過程。優(yōu)點：設備簡單，操作方便缺點：原料的周期長，來源有限，并受地理氣候和季節(jié)等因素的影響，受經濟、技術及倫理各方面的限制。2、生物合成法：最廣泛使用的方法定義：經過預先設計，通過人工操作，利用微生物細胞、動植物細胞的生命活動而獲得人們所需酶的技術過程。分類：微生物發(fā)酵產酶（應用最廣）、植物細胞培養(yǎng)產酶、動物細胞培養(yǎng)產酶優(yōu)點：生產周期短，酶的產率高，不受生物資源、地理環(huán)境和氣候條件等影響。缺點：對發(fā)酵設備和工藝條件要求高。3、化學合成法定義：按照酶的化學結構中氨基酸或核苷酸的排列順序，通過化學反應將一個一個的單體（氨基酸或核苷酸）連接起來而獲得所需酶的技術過程。缺點：反應步驟多，只適于短肽，受試劑、設備和成本等因素限制。只合成化學結構十分清楚的少數(shù)酶轉錄的基本過程：（轉入的起始、RNA鏈的延伸和RNA鏈合成的終止）轉錄以DNA為模板，以核苷三磷酸為底物，在RNA聚合酶（轉錄酶）的作用下，生成RNA分子的過程。轉錄過程的特點轉錄的不對稱性：在RNA的合成中，DNA的二條鏈中僅有一條鏈可作為轉錄的模板，稱為轉錄的不對稱性。（反義鏈，有義鏈）反義鏈antisensestrand（無意義鏈，負鏈）：在RNA的轉錄中，用作模板的DNA鏈稱為反義鏈。有義鏈codingstrand（編碼鏈，正鏈）：在RNA的轉錄中，不作為模板的DNA鏈稱為有義鏈。轉錄所需酶：依賴DNA的RNA聚合酶又稱為轉錄酶，是以DNA為模板的一類RNA聚合酶。原核生物：核心酶，全酶（核心酶+σ因子）。真核生物：RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ，都屬于寡聚酶，酶的亞基數(shù)目為4～10個，亞基種類有4～6種。轉錄過程起始位點的識別recognition轉錄起始initiation鏈的延伸elongation轉錄終止termination轉錄后加工modification蛋白質的合成過程（P25）1、氨基酸的活化與轉運氨酰-tRNA合成酶AA+tRNA+ATP氨酰-tRNA+AMP+PPi對于E.coli而言，肽鏈合成時的第一個氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMet）。酶生物合成的調節(jié)（P29）適應酶：通過調節(jié)酶合成的量來控制微生物代謝速度的調節(jié)機制，是在基因轉錄水平上進行的。通過阻止酶的過量合成，節(jié)約生物合成的原料和能量。酶在細胞內的含量取決于酶的合成速度和分解速度。細胞根據自身活動需要，嚴格控制細胞內各種酶的合理含量，從而對各種生物化學過程進行調控。酶濃度調節(jié)的化學本質是基因表達的調節(jié)。在細胞內，所合成的酶的種類及數(shù)量是由特殊的基因信息決定的。DNA所攜帶的酶蛋白遺傳信息，需要通過轉錄和翻譯而合成酶蛋白。在細胞內進行的轉錄或翻譯過程都有特定的調節(jié)控制機制，其中轉錄的調控占主導地位。因此，基因表達的調控主要在轉錄水平上進行。★分解代謝物阻遏作用（原核生物酶簡述分解代謝物阻遏作用的原理及解除方法）分解代謝物阻遏作用是指某些物質（主要是指葡萄糖和其他容易利用的碳源等）經過分解代謝產生的物質阻遏某些酶（主要是誘導酶）生物合成的現(xiàn)象。原理：釋放能量葡萄糖等物質分解代謝ATP↑、AMP↓細胞內的cAMP通過磷酸二酯酶水解生成AMP腺苷酸環(huán)化酶活化受到抑制cAMP的生成受阻胞內cAMP↓cAMP-CAP復合物↓啟動基因位點上沒有足夠的cAMP-CAP復合物RNA聚合酶無法結合在啟動基因位點上轉錄無法進行，酶合成受阻細胞生長、新陳代謝進行ATP↓ADP↑、AMP↑、cAMP↑cAMP-CAP復合物結合到啟動基因的特定位點RNA聚合酶結合到相應位點酶生物合成開始解除方法：為了減少或解除分解代謝物阻遏作用，可以在培養(yǎng)環(huán)境中控制好某些容易降解物質的量或添加一定量的cAMP?！锩干锖铣傻恼T導作用（什么是酶合成的誘導作用？其原理是什么？）酶生物合成的誘導作用是指加入某些物質，使酶的生物合成開始或加速進行的現(xiàn)象。原理？？★酶生物合成的反饋阻遏作用（什么是酶生物合成的反饋阻遏作用？其原理？）酶生物合成的反饋阻遏作用有稱為產物阻遏作用，是指酶催化反應的產物或代謝途徑的末端產物使該酶的生物合成受到阻遏的現(xiàn)象。原理？★端粒酶(P33)是催化端粒合成和延伸的酶。端粒酶是一種核糖核蛋白，包含蛋白質和RNA兩種基本成分?！锟贵w酶（P34）又稱為催化性抗體，是一類具有生物催化功能的抗體分子。第三章酶的生物合成法生產（為什么酶制劑的生產主要以微生物為材料？）★產酶工藝條件及其調節(jié)控制（見P46-47看下）一、細胞活化與擴大培養(yǎng)將保藏的細胞接種于新鮮的培養(yǎng)基上，在一定的條件下進行培養(yǎng)，使細胞的生命活性得以恢復的過程。條件：適合細胞生長、繁殖的最適條件時間控制：培養(yǎng)到細胞對數(shù)生長期為宜二、pH的調節(jié)控制三、溫度的調節(jié)控制四、溶解氧的調節(jié)控制★微生物發(fā)酵產酶的方式及特點（P49）1、固體培養(yǎng)發(fā)酵：設備簡單、操作方便；勞動強度大、原料利用率低、生產周期長。2、液體深層發(fā)酵：酶發(fā)酵生產的主要方式3、固定化細胞發(fā)酵4、固定化原生質體發(fā)酵★簡述提高酶產量的措施？1、添加誘導物能使某些酶的生物合成開始或加速進行的物質。酶的作用底物：大腸桿菌在含乳糖的培養(yǎng)基中能大量合成β-半乳糖苷酶酶的反應產物酶作用底物的類似物進一步研究和開發(fā)廉價的誘導物具有重要的意義和應用前景2、控制阻遏物的濃度阻遏物：能夠引起某些酶的生物合成停止或減速進行的物質產物阻遏：由酶催化作用的產物或代謝途徑的末端產物引起的阻遏作用。分解代謝物阻遏：有分解代謝物（如葡萄糖或其他容易利用的碳源等物質經過分解代謝而產生的物質）引起的阻遏作用?？刂铺荚礉舛?、添加一定量的環(huán)腺苷酸可以解除（減少）分解代謝物阻遏3、添加表面活性劑細胞膜高度的選擇透性表面活性劑》增加細胞的透過性——》利于胞外酶分泌——》酶產量↑4、添加產酶促進劑發(fā)酵動力學是研究發(fā)酵過程中細胞生長速度、產物生成速度、基質消耗速度以及環(huán)境因素對這些速度的影響的學科?！锩干锖铣傻哪Ｊ郊疤攸c細胞在一定條件下培養(yǎng)生長，其生長過程一般經歷調整期、生長期、平衡期和衰退期等4個階段。通過分析比較細胞生長與酶產生的關系,可以把酶生物合成的模式分為4種類型。即同步合成型，延續(xù)合成型，中期合成型和滯后合成型。同步合成型：是酶的生物合成與細胞生長同步進行的一種生物合成模式。特點：酶的生物合成不受分解代謝物的阻遏作用，也不受產物的反饋阻遏作用，而且酶所對應的mRNA很不穩(wěn)定。延續(xù)合成型：酶的生物合成在細胞的生長階段開始，在細胞生長進入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成的一種生物合成模式。特點：酶的生物合成受分解代謝物的阻遏作用，而且酶所對應的mRNA相當穩(wěn)定。中期合成型：酶的生物合成在細胞生長一段時間以后才開始，而在細胞生長進入平衡期以后，酶的生物合成也隨之停止的一種合成模式。特點：酶的生物合成受到產物的反饋阻遏作用或分解代謝物阻遏作用，而且酶所對應的mRNA穩(wěn)定性差。滯后合成型：酶的生物合成在細胞生長進入平衡期以后才開始并大量積累的一種合成模式。特點：酶的生物合成受到阻遏物的阻遏作用，而且酶所對應的mRNA穩(wěn)定性很好?！锂a酶動力學（P57）主要研究細胞產酶速率以及各種環(huán)境因素對產酶速率的影響規(guī)律。固定化細胞發(fā)酵產酶的特點（P58-59）1、提高產酶率；2、可以反復使用或連續(xù)使用較長時間；3、穩(wěn)定性好；4、縮短發(fā)酵周期，提高設備利用率；5、產品容易分離純化；6、適用于胞外酶等胞外產物的生產第四章酶的提取與分離純化細胞破碎方法：機械破碎、物理破碎、化學破碎、酶促破碎機械破碎通過機械運動產生的剪切力，使組織、細胞破碎。搗碎法、研磨法、勻漿法★物理破碎（P74）通過各種物理因素的作用，使組織、細胞的外層結構破壞，而使細胞破碎溫度差破碎法；壓力差破碎法；超聲波破碎法★酶的提?。ǜ拍罴白⒁馐马棧└拍睿好傅奶崛〖疵傅某樘?，是指在一定的條件下，用適當?shù)娜軇ɑ蛉芤海┨幚砗冈希姑赋浞秩芙獾饺軇ɑ蛉芤旱模┲械倪^程。抽提原則：根據酶的結構和溶解特性，選擇適當?shù)娜軇?。極性物質易溶于極性溶劑中；非極性物質易溶于非極性有機溶劑中；酸性物質易溶于堿性溶劑中；堿性物質易溶于酸性溶劑中。酶都能溶解于水，通?？捎盟蛳∷?、稀堿、稀鹽溶液等進行提取，有些酶與脂質結合或含有較多的非極性基團，則可用有機溶劑提取。提高溫度，降低溶液粘度、增加擴散面積、縮短擴散距離，增大濃度差等都有利于提高酶分子的擴散速度，從而增大提取效果。影響酶提取的主要因素溫度適當提高→酶溶解度↑，擴散速度↑→提取效果↑；過度提高→酶失活有機溶劑提取時：應控制溫度在0~10℃pH影響酶的溶解度和穩(wěn)定性提取液的體積提取液的總量一般為原料體積的3~5倍，最好分幾次提取。★等電點沉淀法79原理：兩性電解質在等電點時溶解度最低；不同的兩性電解質有有不同的等電點。缺點：沉淀不完全。因為等電點時兩性電解質分子表面的水化膜仍然存在，使酶等大分子仍有一定的溶解性，而使沉淀不完全。注意：調節(jié)pH時，防止局部過酸或過堿?！镉袡C溶劑沉淀法80有機溶劑使酶沉淀析出的原因：1、有機溶劑的存在使溶液的介電常數(shù)降低，從而使溶質分子間的靜電引力增大，互相吸引而易于凝集。2、有機溶劑與水作用，使溶質分子表面的水膜破壞，也使其溶解度降低而沉淀析出。操作注意：有機溶劑的用量一般為酶液體積的2倍；pH一般調到欲分離酶的等電點附近；一般在低溫條件下操作。凝膠電泳（P104）？？聚丙烯凝膠電泳（為什么SDS-凝膠電泳不受蛋白分子電荷及分子形狀影響？）P106（1）連續(xù)凝膠電泳：只用一層凝膠，采用相同的pH和相同的緩沖液進行的電泳。（2）不連續(xù)凝膠電泳：采用2層或3層性質不同的凝膠（樣品膠、濃縮膠和分離膠）重疊起來使用，采用兩種不同的pH和不同的緩沖液進行的電泳。第五章酶改性的基本理論★酶的改性：通過各種方法使酶的催化特性得以改進的技術過程P123（酶的輔助因子）1、無機輔助因子Mg2+,Zn2+,Fe2+,Cu2+,Mn2+,Ca2+等金屬離子。2、有機輔助因子：分子量較小的有機化合物；在酶催化過程中起著傳遞電子、原子和基團的作用。P124（1）煙酰胺核苷酸維生素B5，也叫維生素PP，抗賴皮病維生素，是吡啶的衍生物，有兩種：煙酸（尼克酸，nicotinicacid）煙酰胺（尼克酰胺，nicotinamide），體內多以煙酰胺形式存在，性質穩(wěn)定。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+，即輔酶Ⅰ）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+，即輔酶Ⅱ）是維生素B5的衍生物。在脫氫酶的催化過程中參與傳遞氫。氧化型：NAD+，NADP+還原型：NADH+H+，NADPH+H+（2）黃素核苷酸核黃素（VB2），是6,7-二甲基異咯嗪和核糖醇結合而成的化合物。核黃素的衍生物與磷酸結合成黃素單核苷酸（FMN）；FMN與一分子AMP縮合，形成黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。氧化型：FMN、FAD還原型：FMNH2、FADH2黃酶（黃素蛋白）的輔酶，參與氧化還原反應氫原子傳遞（3）鐵卟啉過氧化氫酶、過氧化物酶等氧化酶的輔助因子。通過共價鍵與酶蛋白結合牢固，起傳遞電子的作用。（4）硫辛酸（6,8-二硫辛酸）氧化還原酶催化作用中：傳遞氫；酮酸的氧化脫羧反應中：?；鶄鬟f作用。（5）核苷三磷酸：ATP、GTP、CTP、UTP磷酸轉移酶的輔助因子。GTP：還是含Ⅰ型IVS的自我剪接酶的輔助因子。（6）鳥苷含Ⅰ型IVS的自我剪接酶的輔助因子（7）輔酶Q是一系列苯醌衍生物，為一些氧化還原酶的輔助因子。短側鏈的輔酶Q：主要存在于微生物中；長側鏈的輔酶Q10：存在于哺乳動物中。（8）谷胱甘肽（G-SH）L-谷氨酸、半胱氨酸、和甘氨酸組成的三肽，是一些氧化還原酶的輔助因子。（9）輔酶A3’-磷酸腺苷-5’-焦磷酸-泛酸-β-巰基乙胺泛酸（VB3），由α,γ-二羥基-β,β-二甲基丁酸和β-丙氨酸脫水縮合而成。（9）輔酶A（CoA）輔酶A是?；D移酶的輔酶；CoA的巰基可與酰基以高能硫酯鍵結合，在糖、脂、蛋白質代謝中起傳遞?；淖饔?。作為?；d體蛋白的輔基，參與脂肪酸合成的代謝；輔酶A對厭食、疲勞等癥狀有明顯的改善效果。（10）生物素（VB7、VH）由噻吩環(huán)和尿素結合而成，側鏈有一個戊酸，有α,β兩種異構體.是羧化酶的輔酶，比如丙酮酸羧化酶、乙酰輔酶A羧化酶，參與CO2的固定和羧化作用。（11）硫胺素焦磷酸（TPP）硫胺素（VB1，抗腳氣病因子，抗神經炎因子），其衍生物TPP是一個重要的輔酶，由硫胺素焦磷酸化而生成。作為脫羧酶的輔酶——參與α-酮酸的氧化脫羧；作為轉酮醇酶的輔酶——參與磷酸戊糖途徑；（12）磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺：VB6的衍生物VB6（吡哆素），是吡哆的衍生物，有吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺。磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺可以作為氨基轉移酶、氨基酸脫羧酶和半胱氨酸脫硫酶等的輔酶。★酶蛋白的副鍵參與連接蛋白質空間結構的副鍵有：氫鍵、鹽鍵、二硫鍵、酯鍵、疏水鍵、金屬鍵和范德華力等。鹽鍵是由蛋白質分子中氨基和羧基在一定條件下形成，其結合力較強，是蛋白質空間結構的主要穩(wěn)定因素之一?！锩傅陌被釟埢?類(P133-134)接觸殘基：直接與底物接觸的基團，它們參與底物的化學轉變，是活性中心的主要必需基團。包括結合基團和催化基團。輔助殘基：既不直接與底物結合，也不催化底物的化學反應，但對接觸殘基的功能有促進作用。它可促進結合基團對底物的結合，促進催化基團對底物的催化反應。結構殘基：是活性中心以外的必需基團，它們與酶的活性不發(fā)生直接關系，但它們可穩(wěn)定酶的分子構象，特別是穩(wěn)定酶活性中心的構象，非貢獻殘基：也稱為非必需基團。對酶活性的發(fā)揮不起作用，可能在系統(tǒng)發(fā)育的物種專一性方面、免疫方面或者在體內的運輸轉移、分泌、防止蛋白酶降解的方面起一定作用。如果沒有這些基團，酶的壽命、酶在細胞中的分布等方面受到限制。這些基團的存在也可能是酶迄今未發(fā)現(xiàn)的新的活力類型的活力中心。第六章酶分子修飾★酶分子修飾(P138)酶分子修飾定義:通過各種方法使酶分子的結構發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術過程稱為酶分子修飾。即：在體外將酶分子通過人工的方法與一些化學基團（物質），特別是具有生物相容性的物質，進行共價連接，從而改變酶的結構和性質。酶分子修飾的意義提高酶的活力增強酶的穩(wěn)定性降低或消除酶的抗原性研究和了解酶分子中主鏈、側鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對酶分子空間構象的影響酶分子修飾的基本要求和條件基本要求：對酶分子進行修飾必須在修飾原理、修飾劑和反應條件的選擇以及酶學性質等方面都要有足夠的了解。如：（1）酶的穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、pH、抑制劑等。（2）酶活性中心的狀況活性中心基團、輔助因子等。其他如分子大小、性狀、亞基數(shù)等條件：修飾反應盡可能在酶穩(wěn)定條件下進行，并盡量不破壞酶活性功能的必需基團，使修飾率高，同時酶的活力回收高。（1）pH與離子強度pH決定了酶蛋白分子中反應基團的解離狀態(tài)。由于它們的解離狀態(tài)不同，反應性能也不同。（2）修飾反應的溫度與時間嚴格控制溫度和時間可以減少以至消除一些非專一性的修飾反應。（3）反應體系中酶與修飾劑的比例酶分子的主鏈修飾？？1、定義酶分子主鏈：肽鏈或核苷酸鏈；是酶分子結構的基礎。酶分子的主鏈修飾：利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學結構及空間結構發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。2、主鏈的切斷修飾A、主鏈斷裂→酶活性中心破壞→酶催化功能喪失。探測酶活性中心的位置B、主鏈斷裂→酶活性中心的空間結構不變→酶催化功能不變或損失不多，但抗原性發(fā)生改變。（肽鏈有限水解修飾）提高一些酶特別是藥用酶的使用價值C、主鏈斷裂→酶活性中心形成→酶分子顯示催化功能。酶原分子轉換為具有催化活性的酶3、主鏈連接修飾將兩種或兩種以上的酶通過主鏈連接在一起，形成一個酶分子具有兩種或多種催化活性的修飾方法。多酶融合體：在一個酶分子上具有兩種或多種催化活性的酶。將兩種或兩種以上酶的基因融合在一起→融合基因→克隆、表達→多酶融合體?！锓肿觾冉宦?lián)修飾采用含有雙功能基團的化合物，如二氨基丁烷、戊二醛、己二胺等，與酶蛋白分子中兩個側鏈基團反應，形成共價交聯(lián)，可以使酶分子的空間構象更為穩(wěn)定，從而提高酶的穩(wěn)定性的修飾方法稱為分子內交聯(lián)修飾。★大分子結合修飾：目前應用最廣泛的酶分子修飾方法。采用水溶性大分子與酶蛋白的側鏈基團共價結合，使酶分子的空間構象發(fā)生改變，從而改變酶的特性與功能的方法。修飾劑：水溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、蔗糖聚合物等；用前要活化。作用：提高酶活力、增強酶的穩(wěn)定性、降低或消除酶蛋白的抗原性。通過大分子結合修飾，可以提高酶活力，增加酶的穩(wěn)定性，降低或消除酶的抗原性等。（原因）p147★親和修飾：修飾劑只專一地與酶分子某一個位點上的某一個基團發(fā)生反應，而與此位點以外的同一種或不同中基團都不發(fā)生作用的修飾方法。專一性不可逆抑制劑可以分為結合型（Ks型）不可逆抑制劑和催化型（Kcat型）不可逆抑制劑兩種。Ks型不可逆抑制劑：根據底物的結構設計的，具有與底物相似的結構?？膳c酶專一性的結合，同時有一個與酶活性中心的某個必需基團反應的基團，從而對某個必需基團進行修飾。Kcat型不可逆抑制劑：根據酶的催化機制設計的。可以與酶分子結合并被催化。同時還有一個潛在的反應基團可以在酶的催化作用下被活化，活化的基團可與酶活性中心中的基團進行共價結合修飾，從而導致酶的不可逆喪失催化活性。★酶分子的物理修飾（原理、特點）定義：通過各種方法，使酶分子的空間構象發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法稱為酶分子的物理修飾。作用：可以了解不同物理條件下，特別是在極端條件下（高溫、高壓、高鹽、極端pH值等）由于酶分子空間構象的改變而引起酶的特性和功能的變化情況。特點：不改變酶的組成單位及其基團，酶分子中的共價鍵不發(fā)生改變，只是在物理因素的作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排。第七章酶固定化★固定化酶：固定在一定載體上并在一定空間范圍內進行催化反應的酶?！锇穹ǘx：將酶、細胞或原生質體包埋在各種多孔載體中，使其固定化的方法。分類：根據載體的材料和方法的不同分為凝膠包埋法（網格型包埋法）、半透膜包埋法（微囊型包埋法）1、凝膠包埋法：應用最廣泛的固定化方法。定義：以各種多孔凝膠為載體，將酶、細胞或原生質體包埋在凝膠的微孔內的固定化方法。載體：瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠、聚丙烯酰胺凝膠等。注意事項：凝膠的孔徑應控制在小于酶分子直徑的范圍內；不適于那些底物或產物分子很大的酶類的固定化。（1）瓊脂凝膠包埋法方法：瓊脂→加水加熱溶解→冷卻至48~55℃→加入酶、細胞或原生質體的懸浮液并迅速攪拌均勻→趁熱將混懸液分散在預冷的甲苯或四氯乙烯溶液中→制的球狀固定化膠?！蛛x、洗凈、備用特點：瓊脂凝膠的機械強度差；氧氣、底物、產物的擴散較困難。（2）海藻酸鈣凝膠包埋法方法：配制一定濃度的海藻酸鈉溶液→滅菌→與酶、細胞或原生質體懸浮液混合均勻→將懸液滴加到一定濃度的氯化鈣溶液中→制的球狀的固定化膠粒。特點：操作簡便、條件溫和；對細胞無毒性；通過改變海藻酸鈉的濃度可以改變凝膠的孔徑；磷酸鹽會破壞凝膠的結構；一般在培養(yǎng)基中保持一定濃度的鈣離子，以維持凝膠結構的穩(wěn)定性。（3）角叉菜膠包埋法方法：角叉菜膠懸浮于水中→加熱溶解、滅菌→冷卻至35~55℃→與酶、細胞或原生質體懸浮液混勻→趁熱滴到預冷的氯化鉀溶液中→制得球狀固定化膠粒。特點：制備簡便；對細胞和原生質體無毒害；通透性能較好；具有一定的機械強度。（4）明膠包埋法方法：配制一定濃度的明膠懸浮液→加熱溶解、滅菌→冷卻至35℃以上→與酶、細胞或原生質體懸浮液混勻→冷卻制成所需的形狀。特點：不適用于蛋白酶及產生蛋白酶的細胞或原生質體的固定化；如機械強度不夠，可用戊二醛等雙功能試劑交聯(lián)強化。（5）聚丙烯酰胺凝膠包埋法方法：配制一定濃度的丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺溶液→與酶、細胞或原生質體懸浮液混勻→加入過硫酸鈣及四甲基乙二胺→混合、靜止、制得固定化膠粒。特點：所得固定化細胞機械強度高；可通過改變丙烯酰胺的濃度調節(jié)凝膠孔徑的大?。槐M量縮短聚合時間，以減少丙烯酰胺單體對細胞的毒害作用。（6）光交聯(lián)樹脂包埋法方法：選擇一定分子量的光交聯(lián)樹脂預聚物→加入1%左右的光敏劑→加水、加熱到50℃左右溶解→與酶、細胞或原生質體懸浮液混勻→鋪成薄層→紫外光照射3min左右→無菌條件下切成一定的形狀。特點：通過選擇不同分子量的預聚物可改變樹脂孔徑；光交聯(lián)樹脂強度高，可連續(xù)使用較長時間；短時的紫外照射即可完成固定化，對細胞的生長繁殖和新陳代謝無明顯的影響。2、半透膜包埋法定義：將酶或細胞包埋在由各種高分子聚合物制成的小球內，制成固定化酶或固定化細胞。載體：聚酰胺膜、火棉膠膜等。適用：底物和產物都是小分子物質的酶的固定化。方法：將酶液滴分散在與水互不相溶的有機溶劑中，在酶液滴表面形成半透膜，將酶包埋在微膠囊中。★結合法定義：選擇適宜的載體，使之通過共價鍵或離子鍵與酶結合在一起的固定化方法。分類：根據酶與載體結合的化學鍵不同分為離子鍵結合法、共價鍵結合法1、離子鍵結合法定義：通過離子鍵使酶與載體結合的固定化方法。載體：某些不溶于水的離子交換劑，如DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠方法：一定條件下，酶與載體混合攪拌幾小時，或是將酶液緩緩流過處理好的離子交換柱。特點：結合力較弱，在pH、離子強度等條件改變時，酶容易脫落。使用注意：pH、離子強度、溫度等的控制。2、共價鍵結合法定義：通過共價鍵將酶與載體結合的固定化方法。常用載體：纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等可以形成共價鍵的基團：氨基、羧基、巰基、羥基、酚基和咪唑基等。特點：結合牢固、酶不會脫落、可連續(xù)使用較長時間；載體活化的操作復雜；共價結合可能影響酶的空間結構，從而影響酶的催化活性。共價鍵結合法制備固定化酶的“通式”：由于載體上的功能基團與酶分子上的側鏈基團間不具有直接反應的能力，因此在偶聯(lián)反應前，需先進行載體活化。首先載體上引進活潑基團；然后活化該活潑基團；最后此活潑基團再與酶分子上某一基團形成共價鍵（關鍵）載體活化的方法：A、重氮法：需要載體具有芳香族氨基。含苯氨基的不溶性載體與亞硝酸反應→生成重氮鹽衍生物，載體引入了活潑的重氮基團→重氮基團可與酶分子中的酚基或咪唑基發(fā)生偶聯(lián)反應。B、疊氮法含酰肼基團的載體用亞硝酸活化→生成疊氮化合物→疊氮基團與酶分子中的氨基、羥基或巰基等反應。C、溴化氰法含有羥基的載體用溴化氫活化→生成亞氨基碳酸衍生物→在微堿性條件下，亞氨基碳酸基團可與酶分子上的氨基反應。D、烷基化法含羥基的載體用多鹵代物進行活化→形成含鹵素基團的活化載體→鹵素基團可與酶分子上的氨基、巰基、羥基等發(fā)生烷基化反應。★固定化酶的特性（問固定化酶穩(wěn)定性的變化？）則需答出其表現(xiàn)和原因＊一、穩(wěn)定性§穩(wěn)定性的表現(xiàn)：1、對熱穩(wěn)定性提高，可以耐受較高的溫度。如氨基?；?、保存穩(wěn)定性好，可以在一定條件下保存較長時間。3、對蛋白酶的抵抗力增強，不易被蛋白酶水解。4、對變性劑的耐受性提高。§穩(wěn)定性的原因固定化后酶分子與載體多點連接，可防止酶分子伸展變形。酶活力的釋放是緩慢的，阻擋不利因素對酶的侵襲。抑制自降解，提高了酶穩(wěn)定性，限制了酶分子間的相互作用，使酶失去了相互作用的機會。＊最適pHP164§1、載體性質對最適pH的影響載體帶負電荷，最適pH向堿性方向移動。載體帶正電荷，最適pH向酸性方向移動。影響的原因：因為固定化酶顆粒在水溶液中，是被一層幾乎不流動的液體包圍著，這層不流動液體叫做擴散層，擴散層與其周圍外部溶液之間存在著Donnan平衡效應。若是多陰離子載體就會吸引溶液中的陽離子（如H+），使其附著于載體表面，導致擴散層的H+濃度比其周圍外部溶液高，于是擴散層pH值就比外部溶液pH值低。因此，外部溶液的pH必須向堿側偏移，才能抵消微環(huán)境作用，使固定化酶達到最大效率，因此使用帶負電荷的載體制備的固定化酶，其最適pH比游離酶高。反之，亦然?！?、產物性質對最適pH的影響表現(xiàn)：產物為酸性時，固定化酶的pH值比游離酶的pH值高；產物為堿性時，固定化酶的pH值比游離酶的pH值低；產物為中性時，固定化酶的最適pH一般不改變。原因:擴散限制產物為酸性積聚在固定化酶的催化區(qū)域的催化區(qū)域內pH降低提高周圍反應液堿性pH升高降低的pH，能達到酶所要求的pH葡萄糖氧化酶電極1962年Clark和Lyons提出模型，1967年Updike和Hicks首先制造出葡萄糖氧化酶電極并把它用于葡萄糖的定量分析。★青霉素酶電極以固定化青霉素酶的酶膜與pH電極結合而成。將青霉素酶固定在聚丙烯酰胺凝膠或光交聯(lián)樹脂膜內，然后緊貼在玻璃(pH)電極上即成。當酶電極浸入含青霉素的溶液中時，青霉素酶催化青霉素水解生成青霉烷酸，引起溶液中氫離子濃度增加，通過pH電極測出pH值變化，即可測出樣品溶液中青霉素的含量。微生物傳感器可分為呼吸活性測定型和電極活性測定型兩種第八章酶的非水相催化酶都溶于水，只有在一定量的水存在的條件下，酶分子才能進行催化反應。所以酶在有機介質中進行催化反應時，水是不可缺少的成分之一。有機介質中的水含量多少對酶的空間構象、酶的催化活性、酶的穩(wěn)定性、酶的催化反應速度等都有密切關系，水還與酶催化作用的底物和反應產物的溶解度有關。酶的水化過程酶蛋白分子的離子化基團水化過程，水與酶分子表面帶電基團結合。此時酶自由度很小，沒有表現(xiàn)出催化活性。酶蛋白分子中的極性部分水簇的生長過程，水與酶表面的極性基團結合。酶顯示出活性。水吸附到酶蛋白分子表面相互作用較弱的部位。酶活性隨著水含量的增加而增加。酶分子表面完全水化，被單層水分子覆蓋。水分子在活性位點形成的介電屏蔽作用和水分子聚集造成的傳質阻力使酶活力降低。結合水：緊緊結合在酶分子表面的少部分水溶劑水：溶解于有機溶劑的游離水必需水（essentialwater）：緊緊吸附在酶分子表面，維持酶分子完整的空間構象所必需的最低水量。水活度更能準確描述有機介質反應體系中水與酶催化活性之間的關系。水活度（Aw）：在一定的溫度和壓力下，反應體系中水的摩爾分數(shù)χw與水活度系數(shù)γw的乘積。即Aw=χw×γw(溶劑的疏水性越大，γw越大）熱力學穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性提高；儲存穩(wěn)定性提高；通常情況下，隨著介質中水含量的增加，其熱穩(wěn)定性降低，存在臨界水濃度。1、熱穩(wěn)定性提高的原因：酶結構剛性的增強水介質中，酶分子表面的親水區(qū)與水相接觸，溶液中的水分子與酶分子中的功能團之間形成氫鍵，使酶蛋白形成具有柔韌性的開放型空間結構。非水介質中，酶分子的疏水區(qū)暴露，酶分子的折疊受到破壞，帶電基團之間的相互作用使酶蛋白形成了活性的封閉構象，酶分子的剛性得到增強，對受熱而引起的折疊松散的抗性也隨之增強。2、熱穩(wěn)定性提高的原因：水含量有限水介質中，隨著溫度的升高，酶分子表現(xiàn)出折疊及螺旋結構的松散及一種或多種變性反應。無水或含微量水的非水介質中，缺少了足夠的水分子參與，那些變性反應受到了有效的抑制?！飌H記憶：在有機溶劑中酶的最適pH與水相中酶的最適pH相同，即酶能夠記住最后保存其的水溶液的pH。分子記憶：根據分子識別理論，酶通過配體的誘導、相互作用改變酶的構象，從而獲得與配體類似物結合的能力，這種有配體誘導產生的酶的記憶方法就是分子記憶。大題：1、非水介質中，水對酶的影響？酶催化反應是在環(huán)繞著酶分子表面的水層內進行的，所謂非水體系并不是絕對無水的，而是一種含有微量水的有機溶劑體系(水含量≤1％)。在這種體系中，宏觀上是有機溶劑，微觀上是水體系。酶催化反應時，底物分子須先從有機相進入水相，然后才能與酶形成底物—酶復合物，繼而發(fā)生反應。酶蛋白質分子表面含有大量帶電基團和極性基團，在絕對無水條件下，這些帶電基團因相互作用而形成“鎖定”的失活構象。加入適量水充當潤滑劑，酶分子與水分子之間可形成氫鍵使酶的柔性增大，維持酶的活性。生物反應體系中的水絕大多數(shù)(98％)是作為真正的溶劑水(bulkwate)，而少部分的水緊密結合在酶分子的表面，并被稱為結合水(boundwater)。結合水的物理性質如熔點、熱容、EPR和IR的光譜特征與溶劑水不同。結合水對酶的結構和催化活性至關重要，因此結合水又被稱為結構水(structuralwatert)或稱必需水(essentialwater)。據此可以推測若用有機溶劑僅取代溶劑水而不取代結構水，特I不會對酶的活性產生很大影響。1）水對酶的柔性1、酶分子水化無水條件→酶分子的帶電基團和極性基團之間通過相互作用形成一種非活性的“封閉”結構→加入水→這種相互作用減弱→“封閉”結構“疏松”→柔韌性增加→以非共價作用力維持酶的催化活性構象。酶活性部位保持一定的柔性是酶表現(xiàn)其催化活性所必需的。2、酶的水化過程酶蛋白分子的離子化基團水化過程，水與酶分子表面帶電基團結合。此時酶自由度很小，沒有表現(xiàn)出催化活性。酶蛋白分子中的極性部分水簇的生長過程，水與酶表面的極性基團結合。酶顯示出活性。水吸附到酶蛋白分子表面相互作用較弱的部位。酶活性隨著水含量的增加而增加。酶分子表面完全水化，被單層水分子覆蓋。水分子在活性位點形成的介電屏蔽作用和水分子聚集造成的傳質阻力使酶活力降低。水參與一些非共價鍵的形成來維持酶的構象，使酶有一定的柔性，能趨向于最佳催化狀態(tài)所需的構象變化。但水含量高，酶柔性過大，也會使酶構象改變、失活。有機溶劑中，溶劑無法提供形成多種氫鍵的能力，甚至還會使酶帶電基團之間靜電作用加強，使酶剛性增加，活性降低。水含量在最適含量時，酶結構的動力學剛性與熱力學穩(wěn)定性之間達到最好的平衡，酶的活力最大。2)水對酶的穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性提高；儲存穩(wěn)定性提高；通常情況下，隨著介質中水含量的增加，其熱穩(wěn)定性降低，存在臨界水濃度。3）水對酶的活力1、水對非水介質中酶活力的影響在有機介質中，酶的最大催化活力都在相同的最佳水活度下，與溶劑的極性無關，而最佳水活度都在0.55左右。對于固定化酶，多數(shù)載體不直接影響酶分子與水分子的相互作用2、非水介質中，有機溶劑對酶的影響？在使用不同的酶或者在不同的反應體系中，最適于使用的有機溶劑也是不同的。有機溶劑影響酶催化的途徑有三種:一是有機溶劑與酶直接發(fā)生作用，通過干擾氫鍵和疏水鍵等改變酶的構象，從而導致酶的活性被抑制或酶的失活;二是有機溶劑和能擴散的底物或產物相互作用，影響正常酶催化反應的進行;三是有機溶劑還可以直接和酶所需的必需水相互作用。一般認為在非水介質中添加親水性或和水互溶性的有機溶劑對反應不利，因為它們會奪取酶周圍微環(huán)境的必需水，從而使酶失活，所以選擇的有機溶劑疏水性越強越好。有機溶劑疏水性的強弱通常是用有機溶劑在水和正辛醇中的分配系數(shù)P表示。Laane等人【20j認為，在使用lgP值小于2的有機溶劑時酶的活性較低，而在合成反應(如酷化反應)中，所選的lgP值大于4時被認為是有利的。一般所選擇的有機溶劑為飽和烷烴和芳香烴，如苯、甲苯、己烷和異辛烷等。但是事實也并非完全如此一些研究表明，當以各種有機溶劑在水相的濃度相等為基礎相比較時，將呈現(xiàn)上述順序相反的趨勢，即極性越小(lgP高)的有機溶劑對酶活有害。在這些場合中，用于比較的化合物都有較高的lgP。因為隨著極性的減小，有機溶劑在水中溶解度的降低比其使酶失活能力的降低幅度更大，因而此時高地P的有機溶劑對酶的活性具有稍強的抑制能力。1)對酶的結構與功能2）對酶的活性有機溶劑對酶活性中心的影響:溶劑通過減少酶活性中心的數(shù)量對酶的活性產生影響。因為溶劑破壞了酶蛋白活性中心的氫鍵、離子鍵或者造成酶蛋白去折疊而導致活性中心的減少。非極性有機溶劑與底物競爭酶的活性中心的結合位點，從而降低了活性中心的極性，減弱了底物與活性中心的結合能力。3）對底物與產物的影響有機介質中酶的反應：底物→進入必需水層→進入酶的活性中心→發(fā)生反應產物→分布在必需水層→轉移出水層→反應繼續(xù)有機溶劑能改變酶分子必需水層中底物和產物的濃度有機溶劑極性很小，疏水性太強→疏水性底物在有機溶劑中溶解度大→難于進入必需水層→降低催化速度有機溶劑極性過大→親水性太強→疏水性底物在有機溶劑中溶解度低→底物濃度降低→催化速度減慢應該選擇極性適中的有機溶劑作為介質使用1、底物選擇性非水介質中，有機溶劑與底物間的疏水作用比底物與酶間的疏水作用強→疏水性強的底物容易受到有機溶劑的作用→與酶分子的結合受到影響?？梢姡袡C溶劑改變，酶的底物專一性也會發(fā)生改變。極性較強的有機溶劑中，疏水性強的底物容易進行反應。極性較弱的有機溶劑中，疏水性較弱的底物容易進行反應。第九章酶應用的基本理論酶反應動力學定義：研究酶催化反應速度及其影響因素的學科，是酶學研究的重要內容，也是酶應用的重要理論依據。動力學數(shù)據處理以及動力學常數(shù)的求取（4種方程）Lineweaver-Burk方程：對米氏方程兩側取雙倒數(shù)Eadie-Hofstee方程：對米氏方程進行改寫Hanes方程：對米氏方程進行改寫直接線性作圖法：將米氏方程改寫成常用動力學數(shù)據處理方法的比較：Lineweaver-Burk法：最常用的方法，其優(yōu)點是變量v和[S]在不同的軸上；缺點是在圖線上1/v和1/[S]取值范圍內存在不均衡的誤差分布。Eadie-Hofstee法和Hanes法：其圖線中誤差分布是均衡的。直接線性作圖法：v和[S]值直接表示在圖線上，不需要計算就可以得到Vmax和Km值；具有統(tǒng)計合理性，使用Vmax和Km的中位數(shù)，減少了v和[S]的極端值對這些參數(shù)的影響。米氏方程1913年Michaelis和Menten在前人工作的基礎上，根據酶反應的中間復合物學說，推導出底物濃度與酶反應速率之間的定量關系，稱之為米氏方程：★米氏方程及常數(shù)的意義1.物理意義：Km值等于酶反應速度為最大速度一半時的底物濃度。2.Km值愈大，酶與底物的親和力愈?。籏m值愈小，酶與底物親和力愈大。酶與底物親和力大，表示不需要很高的底物濃度，便可容易地達到最大反應速度。3.Km值是酶的特征性常數(shù)，只與酶的性質，酶所催化的底物和酶促反應條件(如溫度、pH)有關，與酶的濃度無關。酶的種類不同，Km值不同，同一種酶與不同底物作用時，Km值也不同。4.米氏方程描述了酶催化反應速度與底物濃度之間的關系第十章酶反應器的應用用于酶進行催化反應的容器及其附屬設備稱為酶反應器。酶反應器的分類按結構區(qū)分為攪拌罐式反應器、填充床式反應器、流化