2025屆人教版高考生物一輪復(fù)習(xí)：pcr相關(guān)問題分析

微難點(diǎn)5PCR相關(guān)問題分析

核心提煉

1.PCR過程模型

DNA

十出野匚人田變性再與合成

樣品DNA人+合成引物復(fù)性DNA

變性再與合成引物復(fù)性DNA廣.I

引物管性DNA/---------------------

待產(chǎn)筮望

的DNA

第1輪免制第2輪復(fù)制第3輪復(fù)制

圖形顯示一輪循環(huán)產(chǎn)生的子鏈長度小于互補(bǔ)鏈的長度，只有第三輪循環(huán)時(shí)，才會(huì)合成出

2個(gè)兩條脫氧核昔酸鏈等長的子代DNA,即第〃輪循環(huán)，合成等長的DNA分子數(shù)為2〃

—2?o

2.引物的歸類分析

(DDNA的復(fù)制需要引物的原因：DNA聚合酶只能催化脫氧核糖核甘酸加至已有單鏈的

游離3，一羥基上，而不能使脫氧核糖核甘酸自身發(fā)生聚合。

①引物是一小段單鏈DNA或RNA,它能與DNA母鏈的一段堿基互補(bǔ)配對(duì)。

②細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制以RNA作引物，它的合成是由一種特殊的RNA合成酶——引物酶

所催化的。

③PCR反應(yīng)一般以DNA作引物(因?yàn)镽NA易降解)。

⑵設(shè)計(jì)引物的主要原則

①引物長度應(yīng)大于16個(gè)核甘酸(通常為20?30個(gè)核昔酸)，可防止隨機(jī)結(jié)合。

②引物與靶序列間的7XDNA熔解溫度)不應(yīng)過低。

③引物不應(yīng)有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，即不能有4bp以上的回文序列。

④2個(gè)引物間不應(yīng)有4bp以上的互補(bǔ)序列或同源序列，在3,端不應(yīng)有任何互補(bǔ)的堿基。

⑤引物中堿基的分布盡可能均勻，G+C含量接近50%。

(3)引物的處理

由于引物延伸從3,端開始，3,端不能進(jìn)行任何修飾，引物5,端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。

有時(shí)需要使經(jīng)PCR擴(kuò)增的目的基因能與載體正常結(jié)合，需要在2種引物的5,端添加不

同的限制酶的識(shí)別序列，保證目的基因定向插入載體并可避免目的基因自身環(huán)化。

(4)引物的選擇和互補(bǔ)鏈的判斷

DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于2個(gè)引物之間的DNA序列，弓|物5,端的堿基與DNA

母鏈3,端的堿基進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，可作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn)，DNA子鏈的合成方向

是從引物開始由5,端向3,端延伸。

3.PCR技術(shù)中的數(shù)量關(guān)系

物質(zhì)（復(fù)制）1次2次3次n次

DNA分子數(shù)2482〃

含引物的DNA分子數(shù)2482"

含引物A（或B）的DNA分子數(shù)1=2-13=22—17=23—12n~\

同時(shí)含引物A、B的DNA分子數(shù)0=2」22=22—26=23—22K—2

共消耗的引物（A和B）數(shù)量2=22—26=23—214=2f2"+1—2

兩條單鏈等長的DNA分子數(shù)0=21—20=22—42=23—62n~2n

DNA分子種類2455

舉題固法

考向1PCR的過程與引物設(shè)計(jì)

題1（2021?江蘇卷）某小組為研究真菌基因m的功能，構(gòu)建了融合表達(dá)蛋白M和tag標(biāo)簽

的質(zhì)粒。請(qǐng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)流程回答下列問題：

SmaI

引物P2/上游同源序列CCCGGG下游同源序列

5r5,-GGAnCTAGA;ACTAGTGGATCCCCCCCC|!GGGGAAAATTTATATTTT|CAAGGTCAAT-3,

溝而1

3I-CCTAAGATCT!TGATCACCTAGGGGGGGG!!CCCCTTTTAAATATAAAA!GTTCCAGTTA-5,

基因加y-----------------------------—

1PCR擴(kuò)增、、、、、經(jīng)單酶切

5'

3_________----------

添加同源序列的6載體A啟動(dòng)子tag序列

酶處理URA3AmpR

R43：酵母篩選標(biāo)記基因，

缺失該基因酵母無法合成尿嗓咤

Amp--.大腸桿菌篩選標(biāo)記，

氨茉青霉素抗性基因

UR43用結(jié)合體AmPR

A-tag序列：編碼特定氨基酸序列，

|導(dǎo)入大腸桿菌可被特異性抗體識(shí)別

（（.fj,X切，導(dǎo)入酵母

II扇動(dòng)子tag序列II~~-----------

URA3_培養(yǎng)篩選融合tag標(biāo)簽

獲得目的菌株的童白M

重組質(zhì)粒Am

（1）目的基因的擴(kuò)增

①提取真菌細(xì)胞RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,進(jìn)一步獲得基因機(jī)片段。

②為了獲得融合tag標(biāo)簽的蛋白M,設(shè)計(jì)引物P2時(shí)，不能包含基因機(jī)終止密碼子的編

碼序列，否則將導(dǎo)致蛋白M上不含tag標(biāo)簽。

③熱啟動(dòng)PCR可提高擴(kuò)增效率，方法之一是先將除ThqDNA聚合酶（7hq酶）以外的各成

分混合后，加熱到80。。以上再混入酶，然后直接從94℃開始PCR擴(kuò)增。下列敘述

正確的有.BC。

A.Kzq酶最適催化溫度范圍為50?60℃

B.與常規(guī)PCR相比，熱啟動(dòng)PCR可減少反應(yīng)起始時(shí)引物錯(cuò)配形成的產(chǎn)物

C.兩條子鏈的合成一定都是從5,端向3,端延伸

D.PCR產(chǎn)物DNA堿基序列的特異性體現(xiàn)了Taq酶的特異性

（2）重組質(zhì)粒的構(gòu)建

①將S/naI切開的載體A與添加同源序列的機(jī)混合，用特定DNA酶處理形成黏性末

端，然后降溫以促進(jìn).黏性末端堿基配對(duì)一，形成A—m結(jié)合體。將A—機(jī)結(jié)合體導(dǎo)入

大腸桿菌，利用大腸桿菌中的DNA聚合酶及DNA連接酶等,完成質(zhì)粒的環(huán)化。

②若正確構(gòu)建的重組質(zhì)粒A—機(jī)仍能被S/naI切開，則SmaI的酶切位點(diǎn)可能在

因加的連接處、基因加的內(nèi)部_。

（3）融合蛋白的表達(dá)

①用含有尿喀咤的培養(yǎng)基培養(yǎng)UR43基因缺失型酵母，將其作為受體菌，導(dǎo)入質(zhì)粒A—

m,然后涂布于無尿喀咤的培養(yǎng)基上，篩選獲得目的菌株，其機(jī)理是.受體菌在無尿喀

陡的培養(yǎng)基上無法生長，導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體菌含有UR43基因，可以長成菌落一。

②若通過抗原一抗體雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到酵母蛋白中含tag標(biāo)簽，說明.融合基因表達(dá)（或

融合基因正確解碼），后續(xù)實(shí)驗(yàn)可借助tag標(biāo)簽進(jìn)行蛋白M的分離純化。

解析：（1）①以逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA的方式，要先從真菌細(xì)胞中提取基因m轉(zhuǎn)錄出來的

mRNAo②從構(gòu)建好的重組質(zhì)粒上看，tag序列位于目的基因下游，若機(jī)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)

物mRNA上有終止密碼子，核糖體移動(dòng)到終止密碼子時(shí)多肽鏈就斷開，則不會(huì)對(duì)tag序

列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物繼續(xù)進(jìn)行翻譯，蛋白M上就不含tag標(biāo)簽。③hq酶在延伸階段發(fā)揮作用，

最適催化溫度范圍為72℃左右，A錯(cuò)誤；PCR反應(yīng)的最初加熱過程中，樣品溫度上升

到70℃之前，在較低的溫度下引物可能與部分單鏈模板形成非特異性結(jié)合，并在

KzqDNA聚合酶的作用下延伸，結(jié)果會(huì)導(dǎo)致引物錯(cuò)配形成的產(chǎn)物的擴(kuò)增，影響反應(yīng)的特

異性，熱啟動(dòng)可減少引物錯(cuò)配形成的產(chǎn)物擴(kuò)增，提高反應(yīng)的特異性，B正確；DNA分

子復(fù)制具有方向性，都是從5,端向3,端延伸，C正確；hq酶對(duì)堿基序列沒有特異性，

與普通的DNA聚合酶相比，酶更耐高溫，D錯(cuò)誤。（2）①從圖上看，載體A只有一

個(gè)SmaI的酶切位點(diǎn)，故被SmaI切開后，載體由環(huán)狀變?yōu)殒湢頓NA,將SmaI切開

的載體A與添加同源序列的機(jī)混合，用特定DNA酶處理形成黏性末端，然后降溫以

促進(jìn)載體A與添加同源序列的m的黏性末端堿基互補(bǔ)配對(duì)。將A-m結(jié)合體導(dǎo)入大腸

桿菌，利用大腸桿菌中的DNA聚合酶及DNA連接酶等，完成質(zhì)粒的環(huán)化。②重組質(zhì)

粒中，載體A被S/nal切開的位置已經(jīng)與基因機(jī)相連，原來的酶切位點(diǎn)已不存在，若

正確構(gòu)建的重組質(zhì)粒A-m仍能被SmaI切開，則SmaI的酶切位點(diǎn)可能在基因m的

連接處或基因m內(nèi)部。（3）①篩選目的菌株的機(jī)理是導(dǎo)入了質(zhì)粒A—機(jī)的目的菌株由于

含有URA3基因，能在無尿喀陡的培養(yǎng)基上存活，而URA3基因缺失型酵母則不能存

活。②若通過抗原一抗體雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到酵母蛋白中含tag標(biāo)簽，位于tag標(biāo)簽上游的

基因機(jī)應(yīng)該正常表達(dá)，說明融合基因表達(dá)（或融合基因正確解碼）。

審答指導(dǎo)

流程圖的解題步驟：①搞清圖例或特別說明；②根據(jù)單箭頭分析流程的變化；③了解每

個(gè)特殊步驟的文字說明的目的或指向；④小題干的小情境中，尋找填空處前后的邏輯關(guān)

系；⑤沒有明顯邏輯關(guān)系的，則需要從流程圖中尋找答案。

座式（2020.江蘇卷）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出

已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如下圖所示（以EcoRI酶切為例）。請(qǐng)據(jù)圖回答問題：

染色體DNA

5~~短有序列E記知序列1未知序列（片段F

n連接DNA連接酶

已知序列、

PCR引物環(huán)狀DNA

IU擴(kuò)增|TagDNA聚合酶

&PCR產(chǎn)物

IV測(cè)序、分析|

，片段F的

完整序列

⑴步驟I用的EcoRI是一種限制性內(nèi)切核酸（或限制）酶,它通過識(shí)別特定的―核

昔酸序列一切割特定位點(diǎn)。

⑵步驟H用的DNA連接酶催化相鄰核甘酸之間的3，一羥基與5，一磷酸間形成.磷酸二

酯鍵一；PCR循環(huán)中，升溫到95℃是為了獲得DNA單鏈；K/qDNA聚合酶的作

用是催化以DNA為模板的DNA鏈的延伸o

（3）若下表所列為已知的DNA序列和設(shè)計(jì)的一些PCR弓I物，步驟DI選用的PCR引物必

須是一②④_（從引物①②③④中選擇，填編號(hào)）。

DNA序列（虛線處省略了部分核昔酸序列）

已知

5AACTATGCGCTCATGA???GCAATGCGTAGCCTCT-3'

iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii

序列3,-TTGATACGCGAGTACT-CGTTACGCATCGGAGA-5,

①5，一AACTATGCGCTCATGA—3'

PCR②5，一GCAATGCGTAGCCTCT—3'

引物③5，一AGAGGCTACGCATTGC—3'

④5'-TCATGAGCGCATAGTT—3'

⑷對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序，經(jīng)分析得到了片段F的完整序列。下列DNA單鏈序列中（虛線處

省略了部分核甘酸序列），結(jié)果正確的是_L。

A.5'—AACTATGCG...AGCCCTT—3'

B.5f-AATTCCATG...CTGAATT-3f

C.5'—GCAATGCGT…TCGGGAA—3'

D.5'—TTGATACGC...CGAGTAC—3'

解析：DNA連接酶是在相鄰的核甘酸之間形成磷酸二酯鍵。引物與對(duì)應(yīng)的模板鏈能夠

堿基互補(bǔ)，且方向相反，步驟ni需要擴(kuò)增出片段F的完整序列，需要包括已知序列兩端

的未知序列，所以需要引物②（其3,端與環(huán)狀DNA內(nèi)鏈已知序列的5,端互補(bǔ)）和④（其3,

與環(huán)狀DNA外鏈已知序列的5,端互補(bǔ)）。觀察圖知，片段F兩側(cè)均有EcoRI切割后的

末端，EcoRI的識(shí)別序列是G1AATTC,所以F片段一條鏈的5,端開始肯定是AATTC,

只有B符合。

審答指導(dǎo)

引物的選擇或設(shè)計(jì)類問題的解決

（1）一定要知道的原則：引物延伸的方向是不變的，子鏈一定從5,端向3,端延伸。

（2）具體操作：①沿著引物的方向確定模板DNA；②確定引物延伸得到的目標(biāo)DNA；③

找到引物與模板DNA的結(jié)合位置；④引物一定是模板鏈的互補(bǔ)鏈，且方向一定是從夕

端—3,端。

考向2PCR技術(shù)中的數(shù)量關(guān)系

無（20H.江蘇卷節(jié)選）請(qǐng)回答基因工程方面的有關(guān)問題：

（1）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似（見下圖）。圖中引物為

單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。

n變性

vu

第

一

輪

循

環(huán)

①理論上推測(cè)，第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占的比例為15/16。

②在第」一輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核甘酸鏈等長的DNA片段。

（2）設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組弓I物（只標(biāo)注了部分堿基序歹U）

都不合理（見下圖），請(qǐng)分別說明理由。

第1組1「弓1物1...............................................

引物CAGGCT

【引物D?---------r-T—r-T-r-1--------------

AGCCTG

「耳|物I\..................................................................

第2組J

引物+AACTGCAGTT

CGACTGATTA

①第］組：引物I和引物n局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效；

②第2組：引物「自身折疊后會(huì)出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效。

（3）PCR反應(yīng)體系中含有熱穩(wěn)定DNA聚合酶，下面的表達(dá)式不能正確反映DNA聚合酶

的功能，這是因?yàn)镈NA聚合酶只能將單個(gè)脫氧核昔酸連續(xù)結(jié)合到雙鏈DNA片段的

引物鏈上

解析：（1）①由圖可知，由原來的每條母鏈為模板合成的兩個(gè)新DNA分子中，只含有引

物A或引物B,而以新合成的子鏈為模板合成新DNA分子時(shí)，兩種引物都含有，故第

四輪循環(huán)共產(chǎn)生16個(gè)DNA分子，其中含有引物A的分子是15個(gè)，占15/160②PCR

過程需引物，畫出反應(yīng)過程如下圖所示:

兩條鏈等

長的DNA

片段

-----兩條鏈等

-----長的DNA

-----片段

第一輪第二輪第三輪

由圖示可知，第一、二輪循環(huán)合成的DNA的兩條鏈長度均不同，第三輪循環(huán)產(chǎn)生的DNA

分子存在等長的兩條核甘酸鏈。（2）在第1組引物中，引物I的部分堿基序列是一

CAGGCT-,引物H的部分堿基序列是一AGCCTG—,若利用這兩個(gè)引物進(jìn)行DNA擴(kuò)

增，會(huì)因其中的這部分堿基發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而使引物失效。在第2組引物中，引物「

的部分堿基序列是一AACTG—和一CAGTT一,該引物一旦發(fā)生自身折疊，也將會(huì)出現(xiàn)

部分堿基互補(bǔ)配對(duì)而使引物失效。（3）圖中直接將兩個(gè)脫氧核甘酸合成DNA單鏈，這不

能反映DNA聚合酶的功能，因?yàn)镈NA聚合酶只能在DNA模板存在的條件下，將單個(gè)

脫氧核甘酸連續(xù)結(jié)合到DNA片段的引物鏈上。

考向3新情境下PCR技術(shù)

題3（2023?常州期末）重疊延伸PCR技術(shù)是常規(guī)PCR技術(shù)的衍生，它依據(jù)需要連接的基

因中核昔酸序列（或基因片段）設(shè)計(jì)出多對(duì)具有互補(bǔ)末端的引物，先分段對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增,

再將PCR產(chǎn)物混合，其中的重疊鏈將相互搭橋、互為模板而延伸，最終實(shí)現(xiàn)不同來源

的擴(kuò)增片段重疊拼接起來的目的，如圖1所示。請(qǐng)分析并回答下列問題:

引用1I⑧

I@引說

—1

—1-

外顯子AB

圖1

吆心

5'^——■夕

35，

5'引物A，55|^c3

蛋白A基因及設(shè)計(jì)的四種引物

圖2

⑴圖1中的過程②在2個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行,原因是引物互補(bǔ)影響PCR結(jié)果。經(jīng)

過程②后，體系中存在不同長度的DNA片段，獲取所需DNA的方法是（瓊脂糖凝膠）

電泳分離一。①中引物2和引物3的游離部分分別與.外顯子B、外顯子A-的部分序

列同源。

⑵圖1中的過程⑥一不需要.（選填“需要”或“不需要”）另加引物,原因是兩條DNA

的交錯(cuò)部分即可作為其延伸的引物一。進(jìn)行②⑥⑧⑩過程時(shí)，需要在一定的緩沖溶液中

進(jìn)行，⑩過程除圖示條件還需要加入.原料（四種脫氧核昔酸）、耐高溫的DNA聚合酶

（ThgDNA聚合酶）。

（3）重疊延伸PCR技術(shù)可用于基因的定點(diǎn)突變?；蚨c(diǎn)突變是根據(jù)目的基因（如圖2蛋

白A基因）的序列，設(shè)計(jì)4條單鏈寡核昔酸片段為弓|物（圖2中的引物A-D）,原理是取

弓I物A、B進(jìn)行PCR1反應(yīng)，以及弓I物C、D進(jìn)行PCR2反應(yīng)，然后將需要的兩個(gè)片段

混合、延伸并大量擴(kuò)增。圖2引物B和引物C中的“人”代表.突變堿基一，引物B和引

物C堿基序列間存在的關(guān)系是一互處

解析：（1）過程②中的引物2和引物3會(huì)發(fā)生部分互補(bǔ)，需要2個(gè)反應(yīng)體系。分離不同

長度的PCR產(chǎn)物，可通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行。由圖1可知，①中引物2和引物3的

游離部分分別與外顯子B、外顯子A的部分序列同源。（2）由于引物2有一部分與外顯

子A重疊，另一部分與外顯子B重疊，可作為其延伸的引物，所以圖1中的過程⑥不

需要另加引物。②⑥⑧⑩為PCR過程，除了圖中的引物、模板、緩沖液外，還需要添

加四種脫氧核甘酸和ThqDNA聚合酶。（3）基因定點(diǎn)突變是根據(jù)目的基因的序列，使基

因上的某堿基缺失、增添或替換，故圖2引物B和引物C中的“A”代表突變堿基。分

析圖2可知，引物B和引物C堿基序列間存在互補(bǔ)關(guān)系。

問題

?（2023?江蘇卷）為了將某納米抗體和綠色熒光蛋白基因融合表達(dá)，運(yùn)用重組酶技術(shù)構(gòu)

建質(zhì)粒，如圖1所示。請(qǐng)回答下列問題：

擬構(gòu)建的注：EGFP熒光蛋白

基因結(jié)構(gòu)—AnBl納米抗體

PCR引物及

“目的產(chǎn)物片段

線性質(zhì)粒

基因重組載體

克隆流程

注：—表示PCR引物;

相同背景方框表示

同源序列。

01

(1)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增片段F1與片段F2時(shí)，配制的兩個(gè)反應(yīng)體系中不同的有模板、

引物，擴(kuò)增程序中最主要的不同是.退火溫度.。

(2)有關(guān)基因序列如圖2。引物F2—F、Fl—R應(yīng)在下列選項(xiàng)中選用CD。

EGRP基因序歹!J：5"ATGGTGAGCAAGGGC...GACGAGCTGTACAAG3"

基因序歹U：5'CATGTCCAGCTGCAG...CCAAAACCACAACCA3'

圖2

A.ATGGTG...CAACCA

B.TGGTTG...CACCAT

C.GACGAG...CTGCAG

D.CTGCAG...CTCGTC

(3)將PCR產(chǎn)物片段與線性質(zhì)粒載體混合后，在重組酶作用下可形成環(huán)化質(zhì)粒，直接用

于轉(zhuǎn)化細(xì)菌。這一過程與傳統(tǒng)重組質(zhì)粒構(gòu)建過程相比，無需使用的酶主要有.限制酶、

DNA連接酶。

(4)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，下列敘述錯(cuò)誤的有ABC。

A.稀釋涂布平板需控制每個(gè)平板30?300個(gè)菌落

B.抗性平板上未長出菌落的原因一般是培養(yǎng)基溫度太高

C.抗性平板上常常會(huì)出現(xiàn)大量雜菌形成的菌落

D.抗性平板上長出的單菌落無需進(jìn)一步劃線純化

(5)為了驗(yàn)證平板上菌落中的質(zhì)粒是否符合設(shè)計(jì)，用不同菌落的質(zhì)粒為模板，用引物F1

—F和F2—R進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，質(zhì)粒P1?P4的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖3。根據(jù)圖中結(jié)

果判斷，可以舍棄的質(zhì)粒有P3、P4o

.MPlP2P3P4

Dp,‘‘'’]’》‘，

300()—

2()0()—

100()———

500

250—

圖3

(6)對(duì)于PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果符合預(yù)期的質(zhì)粒，通常需進(jìn)一步通過基因測(cè)序確認(rèn)，原因是

電泳只能測(cè)定DNA長度，不能確定堿基序列。

解析:本題主要考查基因工程的相關(guān)知識(shí)。⑴PCR反應(yīng)進(jìn)行的條件包括引物、酶、dNTP、

模板和緩沖液(其中需要Mg2+)等。分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增片段F1與片段F2時(shí)，配制的兩

個(gè)反應(yīng)體系中不同的有模板(片段F1、片段F2)和引物。PCR過程包括變性、復(fù)性和延

伸三個(gè)階段，通過溫度的變化進(jìn)行控制，由于引物和模板存在差異，擴(kuò)增程序中最主要

的不同是退火溫度。(2)據(jù)圖分析可知，PCR擴(kuò)增片段F1與片段F2后，需要通過重疊

延伸的方式構(gòu)建融合基因。引物F2-F的部分序列與引物F1-R的部分序列可互補(bǔ)，

且引物F2-F的部分序列與F1片段(EGFP)靠近右側(cè)(3,端)的序列一致；引物F1-R的

部分序列與F2片段(AnBl)靠近左側(cè)(5,端)的序列互補(bǔ)配對(duì)，因此引物F2—F和引物F1

-R的序列分別與C和D對(duì)應(yīng)。(3)傳統(tǒng)重組質(zhì)粒構(gòu)建需要使用限制酶切割質(zhì)粒使其具

有與目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA連接酶將目的基因和質(zhì)粒連接成重組質(zhì)

粒。將PCR產(chǎn)物片段與線性質(zhì)粒載體混合后，在重組酶的作用下發(fā)生同源重組形成環(huán)

化質(zhì)粒，不需要使用限制酶和DNA連接酶。(4)采用含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，利用稀

釋涂布平板法接種，可能形成的菌落數(shù)較低，不在30?300的范圍內(nèi)，A錯(cuò)誤；抗性平

板上未長出菌落的原因可能是重組質(zhì)粒未能成功導(dǎo)入大腸桿菌，B錯(cuò)誤；轉(zhuǎn)化后的大腸

桿菌需采用含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，一般含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌才能發(fā)展為菌落,

故不會(huì)出現(xiàn)大量雜菌形成的菌落，C錯(cuò)誤；稀釋涂布平板和平板劃線法均為分離純化細(xì)

菌的方法，用稀釋涂布平板法在抗性平板上長出的單菌落無需進(jìn)一步劃線純化,D正確。

(5)EGFP為720bp,AnBl為390bp,二者的總大小為720bp+390bp=l110bp,用引

物Fl—F和F2-R進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，Pl、P2的擴(kuò)增產(chǎn)物與電泳結(jié)果符合，可以舍棄

的質(zhì)粒有P3、P4。(6)瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)僅能用于分析待檢測(cè)DNA分子的大小，無法

確定待檢測(cè)DNA分子的堿基序列，因此對(duì)于PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果符合預(yù)期的質(zhì)粒，通常

需進(jìn)一步通過基因測(cè)序確認(rèn)。

題2（2022.江蘇卷）纖毛是廣泛存在的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)，功能異?？梢l(fā)多種疾病。因此，

研究纖毛形成的作用機(jī)制具有重要意義。請(qǐng)回答下列問題：

⑴纖毛結(jié)構(gòu)如圖I所示，由細(xì)胞膜延伸形成的纖毛膜主要由脂質(zhì)和蛋白質(zhì).組成?；?/p>

體由中心體轉(zhuǎn)變而來，中心體在有絲分裂中的功能是發(fā)出星射線，形成紡錘體（與紡

錘體的形成有關(guān)］。

（2）某病人腎小管上皮細(xì)胞纖毛異常，為了分析纖毛相關(guān)基因X是否發(fā)生了變異，對(duì)基

因X進(jìn)行了PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物測(cè)序。從細(xì)胞樣品中分離DNA時(shí)，可通過交替調(diào)節(jié)鹽濃

度，將與核蛋白結(jié)合的DNA分離出來，溶液中添加NaCl至2.0mol1-1的目的是—渣

解DNA。PCR擴(kuò)增時(shí)，需在一耐熱/耐高溫的DNA聚合酶（hqDNA聚合酶）催化

下，在引物的3，端進(jìn)行DNA鏈的延伸,獲得擴(kuò)增產(chǎn)物用于測(cè)序。

（3）為研究蛋白質(zhì)X在細(xì)胞中的定位，構(gòu)建綠色熒光蛋白GFP與X的融合蛋白，融合蛋

白具有綠色熒光，可指示其在細(xì)胞內(nèi)位置。將x—GRP基因融合片段M導(dǎo)入如圖n所

示載體質(zhì)粒Y,構(gòu)建Y—M重組質(zhì)粒（在EcoRV位點(diǎn)插入片段）。請(qǐng)完成下表。

限制酶識(shí)別序列

BamHIG^GATCC

EcoRVGAT，ATC

HindIIIA^AGCTT

5g/IIA^GATCT

序列編號(hào)Y—M連接處測(cè)序后部分序列

QI5\..AGATCTCCGATATT...3"

Q25L..AGATCTCCAAGCTT..3

Q35\..AAGCTTCCGGATCC...3"

Q45"...AAGCTTCCGATATC...3'

圖m

分步實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)簡易操作、結(jié)果、分析

①選擇圖II引物.a、b；②PCR目的產(chǎn)物約為

PCR鑒定正向重組質(zhì)粒Y—M

100bp

確保M及連接處序列正確③質(zhì)粒測(cè)序，圖ni中正確的是04（選填序列編號(hào)）

④對(duì)照質(zhì)粒Y—GFP（僅表達(dá)GFP）與實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒Y—M

分別導(dǎo)入細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)對(duì)照組整個(gè)細(xì)胞均有綠色熒光而

檢測(cè)融合蛋白定位

實(shí)驗(yàn)組熒光集中在纖毛基部，說明蛋白質(zhì)X在細(xì)

胞中定位于纖毛基部

（4）為研究另一纖毛病相關(guān)基因Z表達(dá)的變化，采用熒光定量PCR法檢測(cè)健康人與病人

基因Z的轉(zhuǎn)錄水平。采集樣本、提取總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA作為模板，PCR

擴(kuò)增結(jié)果顯示，在總cDNA模板量相等的條件下，健康人。值為15,而病人。值為

20（。值是產(chǎn)物熒光強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的PCR循環(huán)數(shù)）。從理論上估算，在PCR擴(kuò)增

20個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物中，健康人樣品的目的產(chǎn)物大約是病人的倍。

解析：（1）纖毛膜是由細(xì)胞膜延伸而來，故成分是一樣的，主要是脂質(zhì)和蛋白質(zhì)。中心體

與有絲分裂過程中紡錘體的形成有關(guān)，動(dòng)物細(xì)胞有絲分裂前期，中心體發(fā)出星射線，形

成紡錘體。（2）DNA在0.14mol-L-1的NaCl溶液中溶解度最低，而可溶于2.0moLL-i的

NaCl溶液，故添加NaCl至2.0molL-i的目的是溶解DNA。PCR擴(kuò)增時(shí)，需在耐高溫

的DNA聚合酶（即TaqDNA聚合酶）的催化下，在引物的3,端進(jìn)行DNA鏈的延伸（DNA

的合成方向是從5,端到3,端）。（3）由圖中限制酶切位點(diǎn)和引物箭頭方向可知，PCR應(yīng)選

擇圖H中的引物a和引物b,則PCR目的產(chǎn)物長度約為300+800=1100bp。在EcoR

V位點(diǎn)插入片段構(gòu)建Y—M重組質(zhì)粒，則Y—M的連接處上游應(yīng)含有HindHI+EcoR

V的識(shí)別序列，下游應(yīng)含有EcoRV+及/機(jī)HI的識(shí)別序列，根據(jù)圖HI中各限制酶識(shí)別

序列，表中序列Q4符合。實(shí)驗(yàn)組熒光集中在纖毛基部，說明蛋白質(zhì)X在細(xì)胞中定位于

纖毛基部。（4）RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA。。值是產(chǎn)物熒光強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的PCR

循環(huán)數(shù)，健康人。值為15,而病人。值為20,說明病人基因Z表達(dá)較弱，達(dá)到同樣

強(qiáng)度時(shí)，健康人比病人多5個(gè)循環(huán)，故從理論上估算，在PCR擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物

中，健康人樣品的目的產(chǎn)物大約是病人的25=32倍。

審答指導(dǎo)

表格型試題的考查主要以實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作步驟、結(jié)果結(jié)論的分析為主體，因此對(duì)探究性

實(shí)驗(yàn)要整體和局部相結(jié)合，要點(diǎn)和易錯(cuò)點(diǎn)相結(jié)合，分析卡點(diǎn)，疏通堵點(diǎn)，抓住增分點(diǎn)，

建立操作要點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹g的“因果循環(huán)關(guān)系”?；蚬こ毯蚉CR問題中常以此形式，

或結(jié)合其他情境進(jìn)行綜合考查。

衍射訓(xùn)練

由于C4途徑有更高的光合作用能力，科學(xué)家正試圖采用基因工程手段將C4植物的相關(guān)

基因克隆到水稻（C3植物）中以提高產(chǎn)量。下表是相關(guān)研究中的一些步驟，請(qǐng)根據(jù)題意完

成以下表格。

實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆椒ú襟E要點(diǎn)

獲得目的基因PCR擴(kuò)增出目的基因片段

構(gòu)建載體質(zhì)粒將目的基因克隆進(jìn)Ti載體質(zhì)粒

大量培養(yǎng)水稻細(xì)胞①進(jìn)行植物細(xì)胞培養(yǎng)獲得愈傷組織

轉(zhuǎn)化細(xì)胞用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)基因細(xì)胞篩選②用含抗生素的培養(yǎng)基篩選（或用選擇培養(yǎng)基篩選）

③調(diào)控培養(yǎng)基中生長素與細(xì)胞分裂素的比例誘導(dǎo)形成完整

誘導(dǎo)植株形成

植株.

轉(zhuǎn)基因植株分析④PCR鑒定基因、酶活力測(cè)定、測(cè)定光合作用能力一

配套精練

1.（2023?揚(yáng)州中學(xué)）某實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)獲取目的基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除目的基因條帶

（引物與模板完全配對(duì)）外，還有2條非特異條帶（引物和模板不完全配對(duì)）。為了減少反

應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是（D）

A.增加模板DNA的量B.延長熱變性的時(shí)間

C.延長延伸的時(shí)間D.提高復(fù)性的溫度

解析：增加模板DNA的量可以提高反應(yīng)速度，但不能有效減少非特異條帶；延長熱變

性的時(shí)間和延長延伸的時(shí)間會(huì)影響變性延伸過程，但對(duì)于延伸中的配對(duì)影響不大，故不

能有效減少反應(yīng)非特異條帶；非特異產(chǎn)物增加的原因可能是復(fù)性溫度過低，造成引物與

模板的結(jié)合位點(diǎn)增加，故可通過提高復(fù)性的溫度來減少反應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生。

2.循環(huán)閾值（。值）是通過PCR等技術(shù)手段，使病毒的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到可檢測(cè)水平所

需的循環(huán)次數(shù)。下列說法錯(cuò)誤的是（B）

A.Ct值為40和Ct值為35的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的量可能相等

B.G值越高，則表示所檢測(cè)的樣本中病毒濃度越高，檢測(cè)所需的時(shí)間越長

C.PCR反應(yīng)過程中每次循環(huán)都要消耗兩種引物

D.PCR反應(yīng)緩沖液中添加的Mg2+可以激活耐高溫的DNA聚合酶

解析：由于樣品中的核酸含量不同，則。值為40和。值為35的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的量可

能相等，A正確；。值越高，則表示所檢測(cè)的樣本中病毒濃度越低，檢測(cè)所需的時(shí)間越

長，B錯(cuò)誤；PCR產(chǎn)生的DNA分子是雙鏈的，每條鏈都需要一種引物，則PCR反應(yīng)過

程中每次循環(huán)都要消耗兩種引物，C正確；用PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，反應(yīng)緩沖液中一

般要添加Mg?+來激活耐高溫的DNA聚合酶，D正確。

3.（2024?連云港調(diào)研）數(shù)字PCR技術(shù)通過將一個(gè)樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同

的反應(yīng)單元，每個(gè)單元最多包含一個(gè)拷貝的目標(biāo)分子（DNA模板），在每個(gè)反應(yīng)單元中分

別對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)各個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,

如下圖所示。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（B）

O無熒光

稀釋、分裝熒光PCR?有熒光

待分析PCR每個(gè)反應(yīng)單元中最檢測(cè)熒光并計(jì)數(shù)，

反應(yīng)體系多含有1個(gè)DNA分子得出目標(biāo)分子起始拷貝數(shù)

A.PCR每一循環(huán)包括變性、復(fù)性（退火）和延伸三步

B.數(shù)字PCR可以在常溫下進(jìn)行，降低了檢測(cè)成本

C.每個(gè)反應(yīng)單元有無熒光取決于是否含有目標(biāo)分子

D.數(shù)字PCR可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中目標(biāo)分子的絕對(duì)定量分析

解析：PCR每一循環(huán)都包括變性、復(fù)性和退火三步，A正確。數(shù)字PCR也是體外DNA

復(fù)制，需要高溫使DNA變性，B錯(cuò)誤。每個(gè)單元最多包含一個(gè)拷貝的目標(biāo)分子，如果

反應(yīng)單元中有目標(biāo)分子，經(jīng)PCR可以擴(kuò)增大量目標(biāo)分子，利用熒光檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)熒光信

號(hào)。如果反應(yīng)單元中沒有分配到目標(biāo)分子，反應(yīng)單元不進(jìn)行DNA復(fù)制，沒有產(chǎn)物，利

用熒光檢測(cè)時(shí)不出現(xiàn)熒光信號(hào)，C正確。起始待測(cè)樣品分配時(shí)，待分析PCR反應(yīng)體系

每個(gè)反應(yīng)單元中最多分配有1個(gè)DNA分子，所以檢測(cè)時(shí)，有多少單元有熒光信號(hào)，待

測(cè)樣品中起始就有多少DNA分子，所以數(shù)字PCR可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中目標(biāo)分子的絕對(duì)定

量分析，D正確。

4.（多選）（2024.淮安調(diào)研）引物在極大程度上決定了PCR的成敗，下列關(guān)于引物的說法，

正確的有（ABD）

A.PCR和生物體內(nèi)的DNA合成都需要引物，PCR引物一般是單鏈DNA

B.若引物的CG堿基含量相對(duì)較高，PCR退火步驟的溫度需要適當(dāng)升高

C.在PCR的退火步驟，兩種引物分別結(jié)合在模板鏈的3,端和夕端

D.若初始有10個(gè)胰島素基因，PCR中進(jìn)行10輪循環(huán)，至少需要20460個(gè)引物分子

解析：PCR和生物體內(nèi)的DNA合成都需要引物，體內(nèi)的DNA復(fù)制引物通常是RNA,

PCR引物一般是單鏈DNA,A正確；G與C之間有3個(gè)氫鍵，穩(wěn)定性高，若引物的CG

堿基含量相對(duì)較高，PCR退火步驟的溫度需要適當(dāng)升高，B正確；在PCR的退火步驟，

兩種引物都結(jié)合在模板鏈的3,端，C錯(cuò)誤；若初始有10個(gè)胰島素基因，PCR中進(jìn)行10

輪循環(huán)，得到10x21°個(gè)=10240個(gè)DNA分子，共1024x2=20480條鏈，由于初始的

20條鏈不需要引物，故至少需要20480—20=20460個(gè)引物分子，D正確。

5.（多選）（2023?南通期末）多重PCR是指在反應(yīng)體系中加入多種引物，最終擴(kuò)增出多種

目的DNA片段的技術(shù)，如圖。相關(guān)敘述正確的是（ACD）

一科白母基因A

弓［物^

一寸小川基因B

引物對(duì)c

0一尸產(chǎn)A尸基因C

_丁基因D

A.多重PCR加入的引物之間不能互補(bǔ)配對(duì)形成局部雙鏈

B.不同對(duì)引物的退火溫度差異越大，擴(kuò)增的特異性越強(qiáng)

C.多重PCR擴(kuò)增出的大小不一的DNA片段可用電泳檢測(cè)

D.多重PCR可用于多種病原體感染的檢測(cè)

解析：多重PCR加入的不同引物的堿基排列順序不能互補(bǔ)，如果互補(bǔ)，就會(huì)造成引物

之間形成雙鏈，不能與模板鏈結(jié)合，降低擴(kuò)增的效率，A正確；一般而言，引物的GC

含量越高，結(jié)合特異性越強(qiáng)，擴(kuò)增的特異性越強(qiáng)，B錯(cuò)誤；電泳技術(shù)可分離不同大小的

DNA分子，故多重PCR擴(kuò)增出的大小不一的DNA片段可用電泳檢測(cè)，C正確；PCR

鑒定病原體的原理是堿基互補(bǔ)配對(duì)，該體系中加入多種引物，最終擴(kuò)增出多種目的DNA

片段，故多重PCR可用于多種病原體感染的檢測(cè)，D正確。

6.(多選)(2024?南通10月質(zhì)監(jiān))交錯(cuò)PCR能實(shí)現(xiàn)同源基因的重組(如圖，僅示單鏈)。第

一輪延伸15s,獲得短產(chǎn)物①②。在第二輪開始時(shí)(95℃)產(chǎn)物①②與原來模板分開，然

后(55℃)隨機(jī)地與不同模板交錯(cuò)結(jié)合，延伸15s,合成交錯(cuò)產(chǎn)物③④。每一輪擴(kuò)增僅延

伸一小段，經(jīng)過多輪“產(chǎn)物一模板”交替結(jié)合、延伸，最終擴(kuò)增出交錯(cuò)重組基因產(chǎn)物。相

關(guān)敘述正確的是(AB)

引物引物

A.交錯(cuò)PCR原理是DNA半保留復(fù)制

B.交錯(cuò)PCR延伸溫度設(shè)定為55℃可增加交錯(cuò)次數(shù)

C.上一輪交錯(cuò)產(chǎn)物需與模板鏈嚴(yán)格配對(duì)才能繼續(xù)下一輪擴(kuò)增

D.若交錯(cuò)循環(huán)20輪，一共產(chǎn)生220個(gè)DNA分子

解析：交錯(cuò)PCR是PCR技術(shù)的延伸，利用了DNA半保留復(fù)制，A正確；在第二輪開

始時(shí)(95℃)產(chǎn)物①②與原來模板分開，然后(55℃)隨機(jī)地與不同模板交錯(cuò)結(jié)合，延伸15

s,合成交錯(cuò)產(chǎn)物③④，故延伸溫度設(shè)定為55℃可增加交錯(cuò)次數(shù)，B正確；交錯(cuò)延伸PCR

與普通PCR技術(shù)的區(qū)別是每輪擴(kuò)增僅延伸一小段，經(jīng)過多輪“產(chǎn)物一模板”交替結(jié)合、

延伸，最終擴(kuò)增出交錯(cuò)重組基因片段混合產(chǎn)物，故上一輪交錯(cuò)產(chǎn)物不需與模板鏈完全配

對(duì)也可繼續(xù)下一輪擴(kuò)增，交錯(cuò)循環(huán)20輪，也可能只產(chǎn)生1個(gè)DNA分子，C、D錯(cuò)誤。

7.基因定點(diǎn)突變是指按照特定的要求，使基因的特定序列發(fā)生插入、刪除、置換、重

排等變異。圖甲是一種PCR介導(dǎo)的基因定點(diǎn)突變示意圖，圖乙是研究人員利用基因Ml

構(gòu)建基因表達(dá)載體的過程。請(qǐng)回答下列問題：

|引物|引物2

；二二一二J基因M

麗^/引物4

AnB

----------基因M]

BamHlGJGATCC

注：|代表酶切位點(diǎn)，HindmA|AGCTT

--------代表兩段特定DNA序列PstlCTGCAIG

甲乙

(1)進(jìn)行基因定點(diǎn)突變的PCR反應(yīng)體系中，除加入引物和模板DNA外，一般還需要加

入預(yù)酶、dNTP(緩沖液、M『+)等,圖甲所示的基因定點(diǎn)突變技術(shù)需要3次PCR,

獲得產(chǎn)物A需要的引物是引物1和引物3。

(2)研究人員對(duì)PCR的中間產(chǎn)物A、B進(jìn)行純化后，利用圖中相關(guān)酶對(duì)基因M和產(chǎn)物

A、B進(jìn)行充分酶切后得到不同的片段，長度(kb)如下表，則圖中基因敲除片段的長度

為。23kb,基因Ml的長度為6.09kb。

基因MAB

長度3.24、2.8、0.15、0.132.8、0.093.24、0.05

(3)通過圖甲過程獲得的基因Ml仍需要大量擴(kuò)增，此時(shí)選擇的引物是引物1和引物

2，為了與圖乙中的Ti質(zhì)粒相連,還需要分別在它們的5端引入限制酶H泳HH、

Ps/I的識(shí)別序列。

(4)構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，Ml基因必需插入Ti質(zhì)粒的T—DNA中,原因是Ti質(zhì)粒

上的T—DNA能夠轉(zhuǎn)移并整合到受體細(xì)胞的染色體上。

解析：(1)進(jìn)行基因定點(diǎn)突變的PCR反應(yīng)體系中，除加入引物和模板DNA外，一般還

需要加入Taq酶、dNTP(緩沖液、Mg?+)等。從圖甲可以看到，從加入引物到獲得基因Ml

總共經(jīng)歷了3