蛹蟲草中HEA的測(cè)定 液相色譜法征求意見(jiàn)稿

1T/ZSJXXXXX—XXXX蛹蟲草中HEA的測(cè)定液相色譜法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測(cè)定蛹蟲草中HEA的液相色譜法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于蛹蟲草子實(shí)體、菌絲體（干品）中HEA的測(cè)定。本方法檢出限為1mg/kg。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T12728食用菌術(shù)語(yǔ)3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1N6-（2-羥乙基）腺苷HEACAS號(hào)4338-48-1，分子式為C12H17N5O5，分子量為311.29，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。HEA是N6-（2-羥乙基)腺苷的英文名稱，是第一個(gè)生物來(lái)源的鈣離子拮抗劑，最早發(fā)現(xiàn)存在于蟲草液體發(fā)酵的菌絲體中，HEA具有抑制癌細(xì)胞繁殖、降低炎癥反應(yīng)、保護(hù)腎臟、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛等多種功效，已經(jīng)成為評(píng)價(jià)蟲草制品質(zhì)量的重要指標(biāo)。T/ZSJXXXXX—XXXX2圖1HEA結(jié)構(gòu)式4原理試樣經(jīng)水提取、定容、離心后，取上清液過(guò)濾膜，經(jīng)C18高效液相色譜柱分離，依據(jù)保留時(shí)間定性，用外標(biāo)峰面積定量。5試劑和材料除非另有規(guī)定，所有試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)室用水符合GB/T6682中規(guī)定的三級(jí)水要求，色譜用水符合GB/T6682中規(guī)定的一級(jí)水要求。5.1HEA標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：4338-48-1）:純度≥98%。5.210%甲醇：取甲醇（5.1）100mL,用水定容至1000mL，混勻，過(guò)0.22μm濾膜（5.5）。5.3HEA標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：精確稱量5.0mgHEA標(biāo)準(zhǔn)品（5.2），用超純水溶解并定容至50mL，使用前配制。5.4HEA標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確吸取一定量的HEA標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（5.4），用超純水分別將其稀釋成濃度為10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL的工作溶液，使用前配制。5.5濾膜（有機(jī)相）：0.22μm。6儀器和設(shè)備6.1液相色譜儀（帶紫外檢測(cè)器）。6.2分析天平：感量0.1mg和感量1mg。。6.3恒溫水浴鍋。6.4粉碎機(jī)。6.5離心機(jī)。6.6加熱型超聲波粉碎機(jī)。T/ZSJXXXXX—XXXX37測(cè)定方法7.1試樣處理7.1.1蛹蟲草子實(shí)體：取蛹蟲草干品進(jìn)行粉碎，過(guò)100目篩子，取篩下物樣品0.5g（精確至0.01g加入超純水80mL，80℃熱提取3h，過(guò)濾，濾液暫存，離心（8800rpm，10min）去除不溶物，用超純水定容至100mL,過(guò)濾膜（5.5），取濾液供色譜測(cè)定。過(guò)濾膜的濾液要在24h內(nèi)完成測(cè)定。7.1.2蛹蟲草菌絲體；取蛹蟲草干品進(jìn)行粉碎，取粉碎后樣品（過(guò)100目篩子）0.5g（精確至0.01g加入超純水80mL，80℃熱提取3h，過(guò)濾，濾液暫存，離心（8800rpm，10min）去除不溶物，用超純水定容至100mL,過(guò)濾膜（5.5），取濾液供色譜測(cè)定。過(guò)濾膜的濾液要在24h內(nèi)完成測(cè)定。7.2高效液相色譜參考條件7.2.1色譜柱：C18柱，柱長(zhǎng)250mm、內(nèi)徑4.6mm、粒徑5μm，或分離效果相當(dāng)?shù)钠渌V柱。7.2.2流動(dòng)相：10%甲醇。7.2.3流速：1mL/min。7.2.4柱溫：35℃。7.2.5進(jìn)樣體積：20μL。7.2.6檢測(cè)波長(zhǎng)：266nm。7.3測(cè)定在相同高效液相色譜條件下，依據(jù)保留時(shí)間對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行定性。HEA標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見(jiàn)圖2。在相同高效液相色譜條件下，依據(jù)外標(biāo)法進(jìn)行定量。將標(biāo)準(zhǔn)工作液（5.5）按照濃度由低到高的順序進(jìn)行測(cè)定，以峰面積對(duì)其相應(yīng)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測(cè)樣品的HEA響應(yīng)值需在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。T/ZSJXXXXX—XXXX4圖2HEA標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.08mg/ml的HPLC色譜圖7.4結(jié)果計(jì)算按照式（1）計(jì)算待測(cè)樣品中HEA的含量：X=………………（1）式中：X——樣品中HEA的含量，單位為微克每克（mg/kg）；C——根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的HEA的濃度，單位為微克每毫升(μg/mL）；V——樣品最終定容體積，單位為毫升（mL）；M——樣品質(zhì)量數(shù)值，單位為克（g）。將符合重復(fù)性要求的三個(gè)獨(dú)立測(cè)定值的算術(shù)平均值作為測(cè)定結(jié)果，保留小數(shù)點(diǎn)后兩位數(shù)值8標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍HEA標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程中R2＞0.999。9精密度在重復(fù)性條件下獲得標(biāo)準(zhǔn)品的六次峰面積測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜2%，精密度良好。10重復(fù)性在重復(fù)性條件下獲得樣品的六次峰面積測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜2%，該方法重復(fù)性良好。11穩(wěn)定性在重復(fù)性條件下獲得樣品的8