水產(chǎn)品中氯霉素檢測(cè)技術(shù)規(guī)范FDIS

B50DB1302唐山市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB1302/T374—2013本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由唐山市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：唐山市畜牧水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心。本標(biāo)準(zhǔn)起草人：鄭百芹、蒙君麗、張建民、葛懷禮、董李學(xué)、劉洋、周鑫、吳穎、肖琎、李玉文、張榮華、牛惠超。DB1302/T374—2013水產(chǎn)品中氯霉素檢測(cè)技術(shù)規(guī)范本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水產(chǎn)品中氯霉素的膠體金免疫層析測(cè)定方法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于水產(chǎn)品中氯霉素殘留的快速集成檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單或修訂版）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)則和試驗(yàn)方法SC/T3016水產(chǎn)品抽樣方法農(nóng)業(yè)部781號(hào)公告-2-2006動(dòng)物源食品中氯霉素殘留量的測(cè)定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-26-2008動(dòng)物源性食品中氯霉素類殘留檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法3抽樣方法按照SC/T3016執(zhí)行。4膠體金免疫層析法4.1適用范圍本方法適用于水產(chǎn)品中氯霉素的快速篩選檢測(cè)，最低檢測(cè)濃度1μg/kg。4.2方法原理膠體金快速檢測(cè)試紙條采用競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析原理。若樣品中含有氯霉素，氯霉素與金標(biāo)抗體相結(jié)合，封閉金標(biāo)抗體上的抗原結(jié)合點(diǎn)，阻止金標(biāo)抗體與纖維素膜上氯霉素偶聯(lián)物結(jié)合，顯色較弱或不顯色；若樣品中不含有氯霉素，則不能阻止金標(biāo)抗體與纖維素膜上的氯霉素偶聯(lián)物結(jié)合，顯色較強(qiáng)。4.3試劑和材料以下所用的試劑，除特別注明外均為分析純?cè)噭?，水為符合GB/T6682規(guī)定的三級(jí)水。4.3.1吸管、緩沖液、氯霉素檢測(cè)條(試劑盒自帶)，4℃~30℃陰涼避光干燥處儲(chǔ)存。4.3.2乙酸乙酯4.3.3正己烷4.4儀器和設(shè)備4.4.1組織勻漿機(jī)4.4.2天平：感量（0.01g）4.4.3振蕩器或混旋器4.4.4微量移液器：?jiǎn)蔚?0μL～200μL、100μL～1000μL4.4.5計(jì)時(shí)器4.4.6吹風(fēng)機(jī)2DB1302/T374—20134.5樣品前處理稱取已均質(zhì)樣品1g(±0.05g）于l5mL離心管中，加入1mL乙酸乙酯，振蕩器震蕩混勻，靜置5min；移液槍吸取澄清液(約300μL～400μL)于50mL錐底離心管中，吹風(fēng)機(jī)冷風(fēng)吹干；用0.3mL正己烷溶解殘?jiān)?，加?.3mL緩沖液，振蕩器振蕩1min，靜置3min，供測(cè)試用。4.6檢測(cè)和結(jié)果判定4.6.1檢測(cè)取出檢測(cè)條，平放，用移液槍或塑料吸管取待測(cè)液80μL(2～3滴)于加樣孔，10min～15min內(nèi)觀察結(jié)果，目測(cè)檢測(cè)線。4.6.2結(jié)果判定結(jié)果判定如圖1所示。其中C線為質(zhì)控線，T線為檢測(cè)線。4.6.2.1C線和T線均呈現(xiàn)肉眼可見紅色線為陰性。4.6.2.2T線無顯色，C線呈現(xiàn)肉眼可見紅色線為陽性。4.6.2.3C線和T線無顯色或只出現(xiàn)T線，C線無顯色的為無效。待測(cè)條陰性陽性無效圖1檢測(cè)結(jié)果判定5酶聯(lián)免疫吸附法5.1適用范圍本方法適用于水產(chǎn)品中氯霉素的快速篩選檢測(cè)，最低檢測(cè)濃度0.25μg/kg。5.2方法原理采用ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被氯霉素抗體，樣品中殘留的氯霉素和酶結(jié)合物競(jìng)爭(zhēng)氯霉素抗體，TMB底物顯色，樣品吸光度值與含氯霉素含量負(fù)相關(guān)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度，再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得到樣品中氯霉素的含量。5.3試劑和材料以下所用的試劑，除特殊注明者外均為分析純?cè)噭凰疄榉螱B/T6682規(guī)定的二級(jí)水。5.3.1氯霉素酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒5.3.2乙酸乙酯5.3.3正己烷3DB1302/T374—20135.3.4復(fù)溶液（試劑盒自帶）5.4儀器設(shè)備5.4.1微孔板酶標(biāo)儀（配備450nm/630nm濾光片）5.4.2均質(zhì)器5.4.3振蕩器5.4.4渦旋儀5.4.5離心機(jī)（轉(zhuǎn)速3000r/min）5.4.6天平（感量0.01g）5.4.7微量移液器：?jiǎn)蔚?0μL～200μL、100μL～1000μL5.4.8氮?dú)獯蹈裳b置5.5樣品前處理按照農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-26-2008方法進(jìn)行樣品前處理。5.6樣品檢測(cè)5.6.1測(cè)定條件:將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20℃~25℃)平衡3每種液體試劑使用前均須搖勻。5.6.2編號(hào)：將氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)樣品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)樣品均做重復(fù)孔。5.6.3加樣：加入標(biāo)準(zhǔn)溶液/樣品50μL，然后每孔分別加入氯霉素酶標(biāo)記物溶液50μL。5.6.4溫育：輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后置于室溫（20℃~25℃)反應(yīng)30min。5.6.5洗滌：揭開封板膜，每孔加入稀釋后的洗滌液250μL，連續(xù)洗板3次，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭戳破）。5.6.6顯色：加入底物溶液A50μL和底物溶液B50μL，振蕩混勻，25℃避光顯色20min。5.6.7測(cè)定：加入終止液50μL，輕輕振蕩混勻，在5min內(nèi)于450nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。5.7結(jié)果判定5.7.1計(jì)算B/B0百分吸光度值（%）=×100%式中：B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測(cè)樣品溶液的吸光度值；B0—0號(hào)標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值。5.7.2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中氯霉素濃度以氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為X軸，對(duì)應(yīng)的百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計(jì)算出樣品中氯霉素的濃度。氯霉素含量(μg/kg)＝C×0.5式中：C：待測(cè)液中氯霉素的含量(μg/kg0.5：樣品稀釋倍數(shù)。6高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法6.1適用范圍本方法適用于水產(chǎn)品中氯霉素的確證檢測(cè)，檢出限為0.1μg/kg，定量下限為0.2μg/kg。DB1302/T374—20136.2方法原理采用間位氯霉素作內(nèi)標(biāo)，試料依次用乙腈、40g/L氯化鈉去蛋白，正己烷脫脂，乙酸乙酯提取，固相萃取柱凈化，氮?dú)獯蹈伞Ｓ酶咝Ц咝б合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定，間位氯霉素內(nèi)標(biāo)法定量。6.3試劑和材料除方法另有規(guī)定外，試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)室用水符合GB/T6682中一級(jí)水的規(guī)定。6.3.1氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品(CAP)6.3.2甲酸：色譜純6.3.3內(nèi)標(biāo)：間位氯霉素(m-CAP)或氘代氯霉素（CAP-D5）6.3.4乙腈：色譜純6.3.5氯化鈉6.3.6正已烷6.3.7乙酸乙酯6.3.8氫氧化鈉溶液：5mol/L6.3.9甲醇：色譜純6.3.1040g/L氯化鈉溶液：稱取氯化鈉4.Og，用水溶解并稀釋至100mL，臨用前配制。6.3.11水飽和乙酸乙酯溶液：取400mL乙酸乙酯于500mL棕色試劑瓶中，加水50mL，加蓋、振搖靜置，使用時(shí)取上層溶液。6.3.12乙腈飽和的正己烷：取100mL乙腈和100mL正己烷混合，振搖靜置，使用時(shí)取上層溶液。6.3.13氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精密稱定氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品10mg，置于100mL容量瓶中，甲醇超聲溶解并稀釋成濃度為100μg/mL。-20℃保存，有效期1年。6.3.14間位氯霉素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液：精密稱定間位氯霉素10mg，置于100mL容量瓶中，甲醇超聲溶解并稀釋成濃度為100μg/mL。-20℃保存，有效期1年。6.3.15氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用流動(dòng)相稀釋成濃度為10ng/mL、50ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。4℃保存，有效期3個(gè)月。6.3.16間位氯霉素內(nèi)標(biāo)工作液準(zhǔn)確量取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液適量，用流動(dòng)相稀釋成濃度為20ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。4℃保存，有效期3個(gè)月。6.3.17C18固相萃取柱(500mg/3cc)6.3.18有機(jī)濾膜：0.22μm6.4儀器和設(shè)備6.4.1高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧電離源6.4.2離心機(jī)：最高轉(zhuǎn)速大于等于6000r/min6.4.3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀6.4.4天平感量為0.0001g）6.4.5分析天平感量0.00001g）6.4.6微量移液槍：20μL～200μL、100μL～1000μL、1mL～5mL6.4.7固相萃取裝置6.4.8渦旋振蕩器6.4.9粉碎機(jī)5DB1302/T374—20136.5試樣制備試料的制備包括：——取絞碎后的供試樣品，作為供試試料?！〗g碎后的空白樣品，作為空白試料?！〗g碎后的空白樣品，添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，作為空白添加試料。6.6操作方法6.6.1提取取10000r/min勻漿1min的供試試料5g(±0.02g)置50mL離心管中，加1μg/mL間位氯霉素內(nèi)標(biāo)工作液10μL，加乙腈5mL，40g/L氯化鈉溶液5mL，渦旋振蕩2min，6000r/min離心10min，取上清液至另一50mL離心管中，重復(fù)提取1次，合并提取液。提取液中加乙腈飽和的正己烷5mL，渦旋振蕩1min，6000r/min離心10min，棄去上層液，重復(fù)1次。加水飽和乙酸乙酯溶液5mL，渦旋振蕩lmin，6000r/min離心5min，將上層液轉(zhuǎn)移到100mL雞心瓶中，重復(fù)提取1次，合并提取液，45℃旋轉(zhuǎn)蒸干，殘?jiān)盟?乙腈(40：60)3mL溶解，備用。6.6.2凈化固相萃取柱依次用甲醇10mL，水10mL預(yù)洗，取備用液過柱。用水3mL洗柱，洗2次后，用流動(dòng)相4mL以1mL/min的速度將樣品洗脫入15mL離心管中。洗脫液中加水飽和乙酸乙酯溶液4mL，渦旋振蕩1min，2000r/min，離心5min，取上層液，重復(fù)提取1次，合并提取液，氮?dú)饬飨麓蹈?。用流?dòng)相1.0mL溶解殘余物后，渦旋震蕩1min，過0.22μm濾膜，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。6.6.3空白試驗(yàn)取空白試料，按6.6.1和6.6.2操作。6.6.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液和間位氯霉素