基因工程的基本操作程序高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

3.2基因工程的基本操作程序本節(jié)聚焦1、基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個(gè)步驟？2、基因工程操作的每一步涉及的技術(shù)和方法有哪些？第一課時(shí)1997年，我國政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種100多個(gè)，減少農(nóng)藥用量40萬噸，增收節(jié)支社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益450億元。你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蟲的機(jī)制是什么嗎？培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一般需要哪些步驟？例如：培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的簡(jiǎn)要過程提取棉花細(xì)胞(含抗蟲基因)蘇云金芽孢桿菌抗蟲基因與運(yùn)載體DNA拼接導(dǎo)入普通棉花(無抗蟲特性)棉花植株(有抗蟲特性)基因工程的基本操作程序：獲：目的基因的篩選與獲取構(gòu)：基因表達(dá)載體的構(gòu)建導(dǎo)：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞檢：目的基因的檢測(cè)和鑒定（核心）

從社會(huì)中來一、目的基因的篩選與獲取1、目的基因的概念：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等相關(guān)的基因。根據(jù)不同的需要，目的基因不同，主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。如：與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。資料：蘇云金桿菌通過產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲?？茖W(xué)家將“殺蟲基因”轉(zhuǎn)入棉花中，棉花產(chǎn)生Bt抗蟲蛋白抵抗蟲害。目的基因2.篩選合適的目的基因（1）已知結(jié)構(gòu)和功能清晰（2）利用測(cè)序技術(shù)、序列數(shù)據(jù)庫（如GenBank）、序列對(duì)比工具（如BLAST）等，找到合適的目的基因。測(cè)定：核酸和蛋白質(zhì)序列查找：存儲(chǔ)和共享在序列數(shù)據(jù)庫中的堿基順序或氨基酸殘基順序及其注釋信息。比對(duì)：查詢核酸序列（氨基酸序列）與數(shù)據(jù)庫中的相似序列。提取蘇云金芽孢桿菌抗蟲基因？快速獲得大量抗蟲基因明確了目的基因后，該怎么獲得它？3.目的基因的獲取方法PCR基因文庫適用于：較小且全部序列已知的目的基因。例：我國首批轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的培育使用PCR基因擴(kuò)增儀PCR技術(shù)由穆里斯等人于1985年發(fā)明，為此，穆里斯于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。什么是PCR？4.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因（1）PCR:①原理、②操作環(huán)境、③目的①原理②操作環(huán)境③目的④優(yōu)點(diǎn)：可以在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因⑤實(shí)質(zhì)：

在體外模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過程p77耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物（2種）穩(wěn)定的緩沖溶液（一般添加Mg2+）②PCR條件:一.目的基因的篩選與獲取四種脫氧核苷酸(dNTP)激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶3.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因什么是引物？引物的作用是什么？思考討論定義：引物是一小段能與DNA母鏈的一小段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。（長(zhǎng)度通常為20-30個(gè)核苷酸）作用：引物為DNA聚合酶提供了游離的3’端，使DNA聚合酶從3’端開始拼接單個(gè)的核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增。什么是引物？引物的作用是什么？（2）PCR擴(kuò)增過程待擴(kuò)增的DNA片段引物耐高溫的DNA聚合酶4種脫氧核苷酸變性溫度上升到90℃以上，雙鏈DNA解旋為單鏈復(fù)性當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。延伸當(dāng)溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。（2）PCR擴(kuò)增過程第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)產(chǎn)物。第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應(yīng)模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪循環(huán)產(chǎn)物。（3）PCR小結(jié)變性復(fù)性延伸溫度：90℃以上過程：目的基因DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃院蠼饩蹫閱捂湝囟龋?0℃左右過程：兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合溫度：72℃左右過程：4種脫氧核苷酸在耐高溫DNA聚合酶的催化下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，添加在引物的3’端，合成新的DNA鏈。反復(fù)循環(huán)結(jié)果：1個(gè)模板DNA分子經(jīng)過n輪PCR，以指數(shù)方式擴(kuò)增，可以擴(kuò)增出2n個(gè)DNA片段。（2）PCR擴(kuò)增過程【典例】下圖表示PCR的前三個(gè)循環(huán)，目的基因位于模板DNA分子中與兩種引物所對(duì)應(yīng)的位置之間，請(qǐng)據(jù)圖回答下列問題：(1)經(jīng)過第幾輪擴(kuò)增后，擴(kuò)增出的含有目的基因的DNA片段才不含黏性末端？比例是多少？

第3輪；1/4。(2)PCR擴(kuò)增的是完整的模板DNA分子嗎？

不是，PCR擴(kuò)增的僅僅是兩種引物之間所對(duì)應(yīng)的特定DNA片段。(3)如果已知某目的基因的序列和結(jié)構(gòu)，利用PCR篩選和擴(kuò)增出該目的基因的關(guān)鍵是什么？

根據(jù)目的基因兩端的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物。習(xí)題鞏固1.下列有關(guān)體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR技術(shù)比較的敘述，錯(cuò)誤的是A.二者子鏈的延伸方向相同，均為5′端→3′端B.二者均需要解旋酶破壞氫鍵來實(shí)現(xiàn)解旋C.體內(nèi)DNA復(fù)制需要能量，PCR反應(yīng)也需要能量D.二者遵循的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則相同√如何對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定？思考討論瓊脂糖凝膠電泳原理：DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過程就叫電泳。較小的DNA片段在凝膠中的移動(dòng)相對(duì)容易，較大的DNA片段移動(dòng)難。通過比較DNA樣品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置(標(biāo)準(zhǔn))，這些已知大小的片段稱為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)樣。－最短最長(zhǎng)Bt基因?qū)朊藁?xì)胞若將Bt基因直接導(dǎo)入棉花細(xì)胞不是更簡(jiǎn)便嘛？那么能否這么做？這么做會(huì)導(dǎo)致什么結(jié)果？？？

游離的DNA進(jìn)入細(xì)胞體,一般會(huì)直接被分解,就算可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄——翻譯成蛋白,游離DNA也無法跟著細(xì)胞分裂進(jìn)行復(fù)制,導(dǎo)致子代細(xì)胞中不再含有目的基因能夠直接導(dǎo)入?基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.基因表達(dá)載體的目的（1）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠在受體細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮作用。2.基因表達(dá)載體的組成位置：功能：RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)?；虻氖锥耍ㄒ欢斡刑厥饨Y(jié)構(gòu)的DNA片段）人們所需要的基因位置：功能：基因的尾端（一段特殊的DNA片斷）終止mRNA的轉(zhuǎn)錄用來鑒別或篩選含有重組DNA分子的細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建二啟動(dòng)子和起始密碼子、終止子和終止密碼子的區(qū)別總結(jié)項(xiàng)目啟動(dòng)子終止子起始密碼終止密碼化學(xué)成分DNA片段DNA片段mRNA上三個(gè)相鄰堿基mRNA上三個(gè)相鄰堿基位置目的基因首端目的基因尾端mRNA首端mRNA尾端作用RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位,驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出RNA決定轉(zhuǎn)錄的結(jié)束翻譯的起始信號(hào)決定翻譯過程的結(jié)束

3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程基因表達(dá)載體構(gòu)建模式圖載體（質(zhì)粒）DNA分子（含目的基因）限制酶處理帶有黏性末端或平末端的切口帶有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種基因表達(dá)載體的構(gòu)建二培育抗蟲棉的簡(jiǎn)要過程使用一種DNA限制酶進(jìn)行切割，共有幾種連接情況？選擇2種不同的限制酶同時(shí)對(duì)目的基因和質(zhì)粒切割，減少自連情況出現(xiàn)；載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質(zhì)粒自連目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接正向連接反向連接11’22’122’1’22’1’1如何解決這一問題？二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建②雙酶切的優(yōu)點(diǎn)A、防止質(zhì)粒重新環(huán)化B、防止質(zhì)粒與目的基因反向連接C、防止目的基因自身環(huán)化1.如圖是利用基因工程技