2025食品中蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素的測定

DeterminationofBacilluscereuscereulidein 前 規(guī)范性引用文 術語和定 原 試 儀器設備與耗 分析步 測 結(jié)果計 精密 其 本文件適用于面米制品、乳及乳制品中蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素的測定，也適用于食物中毒嘔吐物中蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素的測定。下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682試樣中蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素經(jīng)乙腈提取，采用固相萃取柱凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，內(nèi)標法定量。除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682乙腈（CH3CN）甲醇（CH3OH）氯化鈉（NaCl）甲酸（HCOOH）乙酸銨（CH3COONH4）：01%1.0mL1000mL01%甲酸-2.0mmol/L0156g1.0mL甲酸，用水溶解稀釋定容至1000mL01%1.0mL1000mL蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素標準溶液（C57H96N6O18，CAS號：157232-64-9），濃度為25μg/500μL或經(jīng)國家認證并授予標準物質(zhì)證書的標準品。蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素標準中間液（1.0mg/L）：準確吸取標準溶液（5.31）0.200mL10.0mL棕色容量瓶中，用乙腈溶液定容至10.0mL，濃度為1.0mg/L18℃冷凍保存，有效期3個月。蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素內(nèi)標標準中間液（1.0mg/L）：準確吸取標準溶液（5.3.2）0.500，置于10.0mL10.0mL1.0mg/L183蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素標準工作液（0.1mg/L）：準確吸取標準中間液（5.4.1）1.0mg/L）置于10.0mL01mg/L18保存，有效期1.mL，置于10.0mL棕色容量瓶中，并用乙腈溶液稀釋成01mg/L18℃冷凍保存，有效期1個月。01mg/L的標準工作液（5.4.3），10μL、50μL、100μL、200μL、500μL、1000μL10.0mL200μL01mg/L的內(nèi)標標準工作液（5.4.4）（AB8:2）01μg/L、0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L的標準系列溶液，含內(nèi)標濃度為2.0μg/L，現(xiàn)用現(xiàn)配。超高效液相色譜-0.001g高速冷凍離心機：轉(zhuǎn)速不低于10000r/min新型反相固相萃取柱（HLB-P）：200mg，6mL高效除脂硅鋯骨架復合多孔材料固相萃取柱（HMR）：500mg，6mL有機相濾膜：0.22μm微孔濾膜（所選用濾膜應對目標物無吸附）250g的面米制品，采用多點取樣法，取250g樣品，按照1:3比例加水均質(zhì)，18250g的面米制品，則取全部樣品，按照1:318℃以下冷凍保存，取樣前恢復至室溫。1818mg/L）20μL，靜置30min后，準確加入5.0mL乙腈，渦旋混均30s，超聲30min。4℃下000r/min離心10min15mL離心管中，加入5.0mL水，渦旋混合30s，待HLB-PHLB-P柱經(jīng)3.0mL甲醇，3.0mL純水依次活化，取食品樣品提取液（7.2.1）上樣（如果上柱溶液粘度較大，過濾較為緩慢，可以1.2mL/min速度抽濾過柱），待上樣液完全過柱后，以3.0mL純水淋洗小柱，5.0mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液，氮氣濃縮至近干，殘渣用1.0mL初始流動相（流動相A與B體積比為8:2）復溶，過微孔濾膜供上機測定。吸取食物中毒嘔吐物樣品提取液（7.2.2）5.0mL，直接上HMR小柱凈化，棄去前0.5mL過柱液后收集2.0mL過柱溶液，過膜供上機測定。色譜柱：WatersACQUITYUPLCPeptideBEHC18Column，300?色譜柱(21mm×100mm1.7μm）流動相：流動相A相為0.1%甲酸乙腈溶液，B相為0.1%甲酸-2.0mmol/L流速：0.35柱溫：40進樣量：5梯度洗脫程序見表1表1梯度洗脫程序時間（ESI+質(zhì)譜掃描方式：多反應監(jiān)測毛細管電壓：3.5離子源溫度：150脫溶劑溫度：500脫溶劑氣流量：1000碰撞室壓力：0.36監(jiān)測參數(shù)見表2表2蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素監(jiān)測參數(shù)注：*將標準系列工作液分別注入超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，測定相應的蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素及其內(nèi)標的峰面積，以各標準系列工作液的蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素濃度(g/L）為橫坐標，以蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素和13C6-蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素內(nèi)標的峰面積比為縱坐標，繪制標準曲線。將試樣溶液注入超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，測定相應的蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素及其內(nèi)標的峰面積。試液中待測物的響應值應在標準曲線線性范圍內(nèi)，超過線性范圍則應適當減少取樣量后重新測定。試樣中蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素色譜峰的保留時間與相應標準溶液中色譜峰的保留時間相比較，變化范圍應在±2.5％之內(nèi)。選擇的蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素質(zhì)譜定性離子必須出現(xiàn)，至少應包括一個母離子和兩個子離子，且試樣中蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素的兩個子離子的相對豐度比與濃度相當?shù)臉藴嗜芤合啾?，其允許偏差不超過表3規(guī)定的范圍。表 定性確證時相對離子豐度的最大允許偏相對離子豐度>50允許的最大偏差試樣中蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素含量公式（1）??=??

X——ρ——由標準曲線得到的試樣溶液中待測真菌毒素的濃度，單位為納克每毫升V——樣品經(jīng)凈化洗脫后的最終定容體積，單位為毫升m——試樣的取樣量，單位為克f——提取液稀釋因子，食品樣品f=3，食物中毒嘔吐物樣品f=0.以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術平均值表示，計算結(jié)果保留3在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術平均值的20%食品