遺傳學(xué) 工程菌的培養(yǎng)保藏和感受態(tài)制作及轉(zhuǎn)化學(xué)習(xí)資料

工程菌的培養(yǎng)和保存技術(shù)

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)四、五一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?、?shí)驗(yàn)原理三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑四、實(shí)驗(yàn)步驟一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握工程菌的培養(yǎng)方法和常用的工程菌的保存方法1.掌握培養(yǎng)基的配制方法和滅菌的過(guò)程3.學(xué)習(xí)和掌握感受態(tài)細(xì)胞的制備的方法和技術(shù)4.掌握轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的方法二、實(shí)驗(yàn)原理1.工程菌的保存的基本原理2.感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化原理低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素感受態(tài)：處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)的細(xì)菌轉(zhuǎn)化：質(zhì)粒DNA或以其它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。原理：細(xì)菌在0℃、CaCl2低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基—鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短時(shí)間熱擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。將細(xì)菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫一段時(shí)間，促使在轉(zhuǎn)化過(guò)程中獲得新的表型（如Ampr

）得到表達(dá)，然后將此細(xì)菌培養(yǎng)物涂在含相應(yīng)的選擇培養(yǎng)基上。三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑儀器：天平，高壓滅菌鍋，恒溫?fù)u床，恒溫培養(yǎng)箱，超低溫冰箱，超凈工作臺(tái),液氮、酒精燈13個(gè)，打火機(jī)、95%酒精，13個(gè)平板涂抹器等

材料：50mL、1.5mL離心管；吸頭1000uL、吸頭（黃色）１０ｕL、槍1000ｕL、100ｕL、50uL各一把。滅菌液體LB培養(yǎng)基，250mL(于500mL的三角瓶中)0.1mol/L的CaCl2130mL(分成13管)，過(guò)濾滅菌，預(yù)冷0.05mol/L的CaCl213mL（分成13管），過(guò)濾滅菌，預(yù)冷質(zhì)粒（pET28-eIF5A）13uL(100ng/uL)ddH20卡那霉素（Kan）（100mg/mL）(分成13管，5uL/每管)滅菌液體LB培養(yǎng)基13mL(分成13管，1mL/每管)固體培養(yǎng)基26個(gè)(每組2個(gè)，不含和卡那霉素（Kan

）各1個(gè))，實(shí)驗(yàn)7所制所需試劑四、實(shí)驗(yàn)步驟1.LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基的配制配制1升培養(yǎng)基，應(yīng)在950mL去離子水（或蒸餾水）中加入：搖動(dòng)容器直到溶質(zhì)溶解，定容。高壓滅菌。如果配制LB固體平板培養(yǎng)基，則在按上速成分配好、定容后，加入15g瓊脂。高壓滅菌。胰蛋白胨（bacto-tryptone）10g酵母提取物（yeastextract）5gNacl10g2.大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化*細(xì)菌培養(yǎng)從LB平板上挑取新活化的E.coliBL21單菌落，接種于3-5mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)12h左右，直到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。將該菌液以1：100—1：50的比例接種于250mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)直到OD600=0.5左右。*感受態(tài)細(xì)胞的制備（CaCl2法）（1）將1mL培養(yǎng)液加入1mL的離心管中，冰上放置10分鐘，然后4℃4000g離心10分鐘。（2）棄去上清，用預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2

1mL

輕輕懸浮細(xì)胞(用“槍頭”懸浮)，冰上放置15-30分鐘，4℃4000g離心10分鐘。（3）棄去上清，用預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2

0.1mL輕輕懸浮細(xì)胞（用“槍頭”懸?。?，冰上放置幾分鐘。（4）將懸浮細(xì)胞分裝成200uL的小分于預(yù)冷的1.5mL的離心管中(每組分2管即可)，可立即使用或液氮冷凍后，貯存與-80℃的冰箱中。注：整個(gè)過(guò)程均在冰上操作！！實(shí)驗(yàn)結(jié)果（1）將質(zhì)粒DNA溶液（含量不超過(guò)50ng,體積不超過(guò)10uL）和對(duì)照無(wú)菌雙蒸水分別加入制備的感受態(tài)細(xì)胞中，冰上30min.(本實(shí)驗(yàn)用1-2uL，共1ng;水10uL)（2）42℃熱擊45s—1min后,立即冰上放置2min。（3）加入LB液體培養(yǎng)基800μL.37℃低速（120-160rpm）振蕩培養(yǎng)40分鐘左右（4）取上述菌液(轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA溶液)100μL涂布于含Amp的篩選平板上;取無(wú)菌雙蒸水轉(zhuǎn)化的菌液1μL(