實驗動物 沙門菌檢測方法 征求意見稿

本文件規(guī)定了實驗動物沙門菌檢測方法。本文件適用于小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔、犬、猴等實驗動物，以及實驗動物接種物、實驗動物環(huán)境樣本和動物源性生物制品為來源的樣品中沙門菌的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注明日下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注明日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。括所有的修改單）適用于本文件。GB/T14926.42實驗動物細菌學檢測標本采集GB/T14926.43實驗動物細菌學檢測染色法、培養(yǎng)基和試劑GBGB4789.4食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗3原理沙門菌在培養(yǎng)基上有特定的生長、形態(tài)和生理生化特征；菌體抗原與相應抗體結(jié)合，產(chǎn)生凝集反應。沙門菌屬中實驗動物常見沙門菌株有特有的基因組核酸序列，可被基于聚合酶鏈式反應等的核酸擴增技術(shù)所識別。4主要設備和材料恒溫培養(yǎng)箱、實時熒光核酸擴增儀5培養(yǎng)基及試劑5.1培養(yǎng)法用試劑5.1.1亞硒酸氫鈉增菌液（SF）5.1.2Cary-Blair運送培養(yǎng)基5.1.3DHL瓊脂5.1.4木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂5.1.5三糖鐵瓊脂（TSI）5.1.6糖發(fā)酵培養(yǎng)基5.1.7賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基5.1.8氰化鉀培養(yǎng)基5.1.9蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑5.1.10沙門菌多價診斷血清5.1.11半固體瓊脂5.1.12營養(yǎng)瓊脂（NA）5.1.13尿素瓊脂（ph7.2）5.1.14鄰硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)培養(yǎng)基5.1.15丙二酸鈉培養(yǎng)基上述培養(yǎng)基的配置方法參見GB/T14926.43《實驗動物細菌學檢測染色法、培養(yǎng)基和試劑》，未列入GB/T14926.43的試劑，參考GB4789.4附錄中的培養(yǎng)基組成進行配制。5.2核酸擴增法試劑實驗動物沙門菌核酸實時熒光PCR擴增的引物和探針見下表；PCR實驗需要其他試劑見附錄A。引物和探針名稱Salm-FAAGTTGATGGTGCGAGGTTCSalm-RCCACATCATCAGCCTGACACSalm-ProbeVIC-TGGCGGTCCAATGTGGTTAT-BHQ16檢測程序36℃±1℃,過夜36℃±1℃,過夜生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)疑似沙門菌!↓↓靛基質(zhì)-賴氨酸+/-36℃±1℃,18h~24h↓核酸擴增鑒定結(jié)果不符合結(jié)核酸擴增鑒定結(jié)果不符合結(jié)果符合賴氨酸+血清學分型（選做）血清學分型（選做）7操作步驟采取實驗動物回盲部內(nèi)容物、糞便或肛拭子，可參照GB/T14926.42的要求。7.2分離培養(yǎng)7.2.1直接分離培養(yǎng)回盲部內(nèi)容物或糞便或肛拭子（上述樣本充足直接劃線接種DHL瓊脂平板或XLD瓊脂平板，于36℃±1℃分別培養(yǎng)18h~24h。7.2.2增菌分離培養(yǎng)當采集的回盲內(nèi)容物或糞便或肛拭子較少時，可選擇增菌處理，將標本樣品接種的SF增菌液，置36±1℃培養(yǎng)過夜，再接種分離培養(yǎng)基。7.3鑒定7.3.1菌落特征DHL瓊脂上為無色半透明，菌落中心黑色或幾乎全黑色；XLD瓊脂上為粉紅色菌落帶或不帶黑芯，有些為全黑色菌落，有些菌株為黃色菌落帶或不帶黑芯。7.3.2菌體特征革蘭陰性桿菌，無芽孢，無莢膜。7.3.3生化特征按GB4789.4中5.4規(guī)定的生化反應或選用全自動細菌鑒定儀或商品化鑒定試劑盒。7.3.4血清玻片凝集試驗陽性。7.4全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)的應用在分離培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基上的可疑菌落，可應用全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)進行后續(xù)的鑒定。7.5病原基因組核酸擴增檢測需要時，可采用分子病原學方法鑒定。對來自實驗動物的樣品可以進行基因組核酸提取，并參照附錄A的方法進行沙門菌基因組核酸擴增，并參照附錄判定標準進行結(jié)果判定。8結(jié)果報告根據(jù)檢測結(jié)果出具報告。實驗動物沙門菌基因組核酸檢測方法A1材料和試劑A1.1核酸樣品保存液A1.2細菌基因組核酸提取試劑或試劑盒A1.3無核酸酶水（DEPCtreatedH2O）A1.4含Taq酶等成分的PCR體系混合液或等效成分。A1.5引物和探針：根據(jù)表A1序列合成引物和探針，引物和探針加入滅菌無核酸酶水配制成10μmol/L儲備液，-20℃保存。引物和探針序列見正文5.2。A2.檢測方法A2.1實驗動物沙門菌核酸檢測樣品的采集與處理參考GB/T14926.42《實驗動物細菌學檢測標本采集》的一般要求進行實驗動物腸道，特別是盲腸內(nèi)容物樣品的采集（小型嚙齒動物適用糞便樣品應新鮮采集，疑似患病動物的糞便樣品采集應注意生物安全防護；肛拭子樣品采集要做好動物的保定，必要時采取麻醉措施。實驗動物接種物、實驗動物環(huán)境樣本和動物源性生物制品為來源的樣品，在樣品采集時應考慮樣品中沙門菌污染量可能較低，采樣量應有所增加。樣品采集量應滿足后續(xù)核酸提取的需要，可根據(jù)選擇的核酸提取試劑的要求進行控制。用于核酸檢測的樣品應盡快加入含胍鹽的核酸樣品保護液，震蕩混勻后，低溫保存；當日完成檢測，可暫時保存在2~8℃的環(huán)境；當日無法完成后續(xù)核酸提取和擴增檢測的，應儲存于-20℃以下的低溫環(huán)境。A2.2樣品中細菌基因組DNA核酸的提取與保存根據(jù)核酸提取技術(shù)方法的要求或核酸提取試劑的要求進行核酸提取。核酸提取應對提取過程和提取環(huán)境進行控制，防止對樣品對環(huán)境的污染，也需要控制樣品可能對環(huán)境和其他樣品的污染。提出的樣品核酸應做好樣品標識，在后續(xù)擴增完成前應做好保藏。1日內(nèi)可保藏于2~8℃的環(huán)境；長期保藏，于-70℃以下低溫環(huán)境。應避免反復凍融，防止核酸降解。A2.3沙門菌目標片段的擴增與檢測按照附表A.1進行檢測體系的設立。表A.1探針法實時熒光PCR體系的配置體系×12×ProbeqPCR擴增緩存液PCRForwardPrimerPCRReversePrimerProbeRNaseFreedH2OTotalDNA0.40.40.8x2總體積20反應液的配制亦在冰上操作，建立擴增體系后再加入核酸模板。每次檢測除待測樣品外，應同時設計陽性對照、陰性對照和空白對照，空白對照即為不加模板對照（notemplatecontrol，NTC），即在反應中用水來代替模板。擴增程序按照附表A.2進行。表A.2實時熒光PCR反應參數(shù)步驟時間（s）循環(huán)數(shù)預變性301變性5退火、延伸3440注：可使用其他等效的實時熒光PCR檢測試劑進行，反應體系和反應參數(shù)可做相應調(diào)整。A2.4結(jié)果的記錄擴增判定基線和閾值設定原則根據(jù)儀器的噪聲情況進行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣本擴增曲線的最高點為準。應記錄擴增曲線和單個樣品的Ct值。A3檢測結(jié)果的判定A3.1質(zhì)控標準空白對照無Ct值，并且無典型擴增曲線。陰性對照無Ct值，并且無典型擴增曲線。陽性對照樣品的Ct值，應根據(jù)標準樣品的質(zhì)控要求進行控制，擴增結(jié)果應在其標稱Ct值范圍±1之內(nèi)。滿足上述質(zhì)控標準，可根據(jù)收集的樣品擴增熒光曲線和樣品Ct值判定結(jié)果。A3.2A3.2.1待測樣本有典型擴增曲線，且Ct值≤35時，可判定樣品中含有沙門菌基因組DNA。A3.2.2待測樣本有典型擴增曲線，35＜Ct值≤40，需復檢，復檢仍出現(xiàn)35＜Ct值≤40，并