T-WSJD 26-2022 水中嗜肺軍團(tuán)菌檢驗(yàn)方法－酶底物法

ICS91.140.30

CCSC51

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/WSJD26—2022

水中嗜肺軍團(tuán)菌檢驗(yàn)方法——酶底物法

ExaminationmethodforLegionellapneumophilainWater

—Enzymesubstratemethod

2022-09-30發(fā)布2022-11-01實(shí)施

中國(guó)衛(wèi)生監(jiān)督協(xié)會(huì)發(fā)布

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水中嗜肺軍團(tuán)菌檢驗(yàn)方法

——酶底物法

1適用范圍

本文件規(guī)定了水中嗜肺軍團(tuán)菌酶底物檢驗(yàn)方法的原理、設(shè)備試劑、檢測(cè)步驟、結(jié)果報(bào)告、質(zhì)量控制

等。

本文件適用于非飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌的測(cè)定，生活飲用水可參照?qǐng)?zhí)行。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過本文的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

WS394公共場(chǎng)所集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范

3術(shù)語(yǔ)和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。

4方法原理

嗜肺軍團(tuán)菌通過診斷酶在特定的培養(yǎng)基中分解底物，釋放出褐色指示物或不帶有褐色的混濁指示

物，指示檢測(cè)樣品中嗜肺軍團(tuán)菌的存在。

5干擾和消除

樣品中殘留的消毒劑、重金屬離子對(duì)檢測(cè)結(jié)果會(huì)造成干擾，需要時(shí)，應(yīng)在樣品采集前在采樣瓶中加

入硫代硫酸鈉溶液（6.3）和乙二胺四乙酸二鈉溶液（6.4）消除干擾。

6儀器和設(shè)備

6.1無菌采樣瓶：具螺旋帽或磨口塞的500mL廣口玻璃瓶。

6.2量筒：100mL（具1mL刻度）。

6.3無菌帶蓋試管：5mL。

6.4無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）或微量移液器及無菌吸頭。

6.5無菌錐形瓶或取樣瓶：100mL。

6.6培養(yǎng)盤：培養(yǎng)用無菌塑料盤，含6個(gè)大孔，90個(gè)小孔。其中，每個(gè)小孔可容納0.187mL培養(yǎng)

液，大孔可容納20mL培養(yǎng)液。

6.7恒溫培養(yǎng)箱：溫度（37±0.5）℃，相對(duì)濕度約80%。

6.8程控定量封口機(jī)。

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6.9計(jì)時(shí)器。

7培養(yǎng)液和試劑

7.1培養(yǎng)液：按每100mL無菌蒸餾水加入2.02g培養(yǎng)基（成分詳見附錄A或選用市售商品）的比

例配置，蓋上瓶蓋搖勻直至培養(yǎng)基完全溶解（或保持渾濁狀），制成培養(yǎng)液。

7.2預(yù)處理試劑（檸檬酸）：稱取檸檬酸2.04g溶于適量無菌蒸餾水中，定容至100mL。此溶液室

溫下保質(zhì)期為1年。

7.3無菌硫代硫酸鈉溶液：c（Na2S2O3）=0.10mol/L。稱取15.6g硫代硫酸鈉（Na2S2O3）溶于蒸

餾水中至100mL，121℃高壓蒸汽滅菌20分鐘，臨用現(xiàn)配。

7.4無菌乙二胺四乙酸二鈉溶液：ρ（C10H14N2O8Na2·2H2O）=0.15g/mL。稱取15g乙二胺四乙酸

二鈉（C10H14N2O8Na2·2H2O）溶于蒸餾水中至100mL，121℃高壓蒸汽滅菌20分鐘，此溶液保質(zhì)期

為30天。

7.5無菌蒸餾水：取適量蒸餾水，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20分鐘，備用。

7.6質(zhì)控菌株：嗜肺軍團(tuán)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株。

8樣品采集

8.1采樣準(zhǔn)備

調(diào)查了解采集樣品的消毒情況。如采集的是經(jīng)過氯處理或含有余氯的樣品，在采樣瓶（6.1）中加

入無菌硫代硫酸鈉溶液（7.3）；如采集的是重金屬離子含量較高的樣品，加入無菌乙二胺四乙酸二鈉

溶液（7.4）。硫代硫酸鈉溶液按每125mL容積0.1mL的量加入，乙二胺四乙酸二鈉溶液按每125mL

容積0.3mL的量加入。

8.2樣品采集

8.2.1樣品采集：集中空調(diào)冷卻水、冷凝水樣采集按照WS394規(guī)定執(zhí)行；淋浴水樣采集時(shí)，需先用

酒精棉簽擦拭花灑消毒，然后放水1min后采集；溫泉水可在水面下10cm-15cm處采集，其他水樣可

參照WS394要求進(jìn)行采集。

8.2.2每個(gè)采樣點(diǎn)依無菌操作取樣品約500mL。樣品的來源，數(shù)量等需登記，并同樣品一起送到實(shí)

驗(yàn)室。

安全警示：為安全起見，采樣時(shí)應(yīng)做好適當(dāng)防護(hù)。采集空調(diào)冷卻水時(shí)，采樣前應(yīng)關(guān)閉冷卻塔風(fēng)機(jī)，采樣

人員應(yīng)戴齊肘的橡膠手套取樣品。由于空調(diào)連續(xù)運(yùn)行而不能關(guān)閉冷卻塔時(shí)，則需采樣人員佩戴安全護(hù)目鏡和

呼吸道防護(hù)裝備等。

8.3樣品保存

樣品采集后應(yīng)在2天內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，不必冷凍，但要避光和防止受熱，室溫下儲(chǔ)存不得超過15天。

9檢驗(yàn)步驟

9.1接種

9.1.1量取混合均勻的100mL培養(yǎng)液（7.1）于錐形瓶或取樣瓶（6.5）中，備用。

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9.1.2在無菌試管中（6.3）加入2mL預(yù)處理試劑（7.2），將充分混勻的樣品無菌移取2mL加入

其中混勻，室溫放置60s（±5s）后，再次混合試管內(nèi)液體。

9.1.3量取2mL經(jīng)預(yù)處理的樣品（9.1.2）加入100mL培養(yǎng)液（9.1.1）中混勻。將錐形瓶或取樣瓶

中混勻的液體倒入96孔培養(yǎng)盤（6.6），以手撫平培養(yǎng)盤背面，去除孔穴內(nèi)氣泡，用程控定量封口機(jī)

（6.8）封口。

9.2培養(yǎng)

9.2.1封口后的培養(yǎng)盤放入37℃±0.5℃、相對(duì)濕度約80%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)盤紙面一面朝下，孔

格一面朝上，最大限度減少液體損失。培養(yǎng)盤疊放時(shí)，需錯(cuò)開疊放，即培養(yǎng)盤的大孔位于小孔之上，

增加穩(wěn)固性，疊放不要超過10個(gè)培養(yǎng)盤。

9.2.2培養(yǎng)3天后開始觀察培養(yǎng)液性狀變化至第7天，根據(jù)9.4給出判定結(jié)果。

9.3對(duì)照試驗(yàn)

9.3.1陽(yáng)性對(duì)照：取嗜肺軍團(tuán)菌質(zhì)控菌株（7.6）培養(yǎng)物適量加入100mL無菌水為陽(yáng)性對(duì)照樣品，

按9.1和9.2與被檢樣品同步進(jìn)行檢驗(yàn)。

9.3.2陰性對(duì)照：以100mL無菌蒸餾水為陰性對(duì)照樣品，按9.1和9.2與被檢樣品同步進(jìn)行檢驗(yàn)。

9.4結(jié)果判讀

96孔培養(yǎng)盤中的培養(yǎng)液顏色顯褐色（詳見附錄B）或比陰性對(duì)照樣品渾濁的判斷為嗜肺軍團(tuán)菌陽(yáng)

性，在培養(yǎng)7天內(nèi)出現(xiàn)的陽(yáng)性檢驗(yàn)結(jié)果和7天后顯示的陰性檢驗(yàn)結(jié)果均有效。

表1培養(yǎng)液性狀與判定結(jié)果關(guān)系

培養(yǎng)液性狀檢驗(yàn)結(jié)果

相對(duì)陰性對(duì)照樣品，無論渾濁與否，任何顯褐色的跡象嗜肺軍團(tuán)菌陽(yáng)性

相對(duì)陰性對(duì)照樣品，無論是否顯褐色，濁度大于陰性對(duì)照嗜肺軍團(tuán)菌陽(yáng)性

與陰性對(duì)照樣品比較，顏色與濁度無差異嗜肺軍團(tuán)菌陰性

9.5結(jié)果報(bào)告

若培養(yǎng)盤有任意1孔或多孔培養(yǎng)液為嗜肺軍團(tuán)菌陽(yáng)性則報(bào)告為嗜肺軍團(tuán)菌檢出。

10方法靈敏度和特異度

水中嗜肺軍團(tuán)菌酶底物檢驗(yàn)方法的靈敏度＞95%，特異度＞80%。

11質(zhì)量控制

11.1每批樣品應(yīng)按照9.3.1規(guī)定進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)和9.3.2規(guī)定進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)。

11.2每批次培養(yǎng)基應(yīng)按照實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制要求使用嗜肺軍團(tuán)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和非嗜肺軍團(tuán)菌菌株進(jìn)行培

養(yǎng)基質(zhì)量驗(yàn)證。

12實(shí)驗(yàn)室生物安全

應(yīng)符合GB19489的相關(guān)規(guī)定。

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附錄A

（規(guī)范性附錄）

培養(yǎng)基成分

表A.1培養(yǎng)基成分

N-氨基甲酰甲基乙磺酸緩沖液（ACESBuffer）1.0g

酵母浸膏0.35g

硫酸鎂15mg

α酮戊二酸0.1g

丙酮酸鈉15mg

甘氨酸（無氨）0.30g

L-半胱氨酸鹽酸鹽一水合物0.17g

無水硫代硫酸鈉0.7mg

二氯化錳3mg

焦磷酸鐵（III）55mg

硫酸多粘菌素B0.12mg