DB21-T3273-2020-豬偽狂犬病毒野毒株與gE基因缺失疫苗株TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒別方法-遼寧省

ICS11.220DB21B41遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)DB21/T3273—2020豬偽狂犬病毒野毒株與gE基因缺失疫苗株TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒別方法ATaqManReal-timePCRMethodforDifferentiationofWild-typeStrainfromgE-deletedVaccineStrainofPseudorabiesVirus遼寧省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB21/T3273—2020目次前言................................................................................II12345678范圍..............................................................................1規(guī)范性引用文件....................................................................1縮略語............................................................................1儀器和耗材........................................................................1試劑和材料........................................................................1樣品采集、處理和運(yùn)輸..............................................................2熒光qPCR操作程序.................................................................3結(jié)果判定..........................................................................4附錄A（規(guī)范性附錄）溶液配制........................................................6附錄B（規(guī)范性附錄）引物和探針......................................................7IDB21/T3273—2020前言本標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)GB/T1.1-2009的有關(guān)規(guī)定進(jìn)行制定。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口管理。本標(biāo)準(zhǔn)負(fù)責(zé)起草單位：遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心。本標(biāo)準(zhǔn)起草人：蘭德松、顧貴波、周維、楊洺揚(yáng)、李可心、孫世宇、張健、劉賀、李旭、高原、丁靜。本標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布實(shí)施后，任何單位和個(gè)人如有問題和意見建議，均可以通過來電和來函等方式進(jìn)行反饋，我們將及時(shí)答復(fù)并認(rèn)真處理，根據(jù)實(shí)際情況依法進(jìn)行評(píng)估及復(fù)審。歸口管理部門通訊地址：遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳（沈陽市和平區(qū)太原北街2號(hào)），聯(lián)系電話準(zhǔn)起草單位通訊地址：遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心（沈陽市皇姑區(qū)寧山東路29號(hào)），聯(lián)系電話IDB21/T3273—2020豬偽狂犬病毒野毒株與gE基因缺失疫苗株TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒別方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬偽狂犬病毒（pseudorabiesvirus,PRV）野毒株及gE基因缺失毒株的TaqMan熒光PCR檢測方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬血液、組織臟器、精液、鼻腔拭子和細(xì)胞培養(yǎng)物等材料中PRV核酸的檢測以及PRV野毒株與gE基因缺失疫苗株病毒核酸的鑒別檢測。本標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在生物安全I(xiàn)I級(jí)實(shí)驗(yàn)室（BSL-2實(shí)驗(yàn)室）中進(jìn)行。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682NY/T541分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范糖蛋白D（glycoproteinD）gE糖蛋白E（glycoproteinE）偽狂犬病病毒（pseudorabiesvirus）熒光PCR儀、高速冷凍離心機(jī)（可控溫至4℃，離心速度可達(dá)12000r/min以上）、組織研磨儀或研缽、自動(dòng)化核酸提取儀（如選用商品化核酸提取試劑盒）、PCR微量離心機(jī)、2℃～8℃普通冰箱、-20℃以下普通冰箱、-70℃以下超低溫冰箱、移液器（量程0.1μL～2μL、2μL～20μL、20μL～200μL）。無菌無DNA酶的1.5mL離心管、0.2mLPCR反應(yīng)管或八聯(lián)管或96孔反應(yīng)板、與移液器匹配的吸頭。1DB21/T3273—2020?5.1DNAzolReagent：商品化DNA提取試劑，2℃～8℃普通冰箱中保存；或商品化核酸提取試劑盒（如磁珠法核酸提取試劑），通常18℃～25℃保存。5.25.3無水乙醇：-20℃普通冰箱中預(yù)冷。75%乙醇：用無水乙醇和雙蒸水配制，-20℃普通冰箱中預(yù)冷。5.4PBS：磷酸鹽緩沖液（0.02mol/LpH7.2），配制見附錄A。5.58mmol/LNaOH溶液，配制見附錄A。5.62×TaqManFastqPCRMasterMix：為商品化探針法實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)專用試劑，包含反應(yīng)所需的緩沖液、酶、dNTP、Mg+等的預(yù)混液，-20℃普通冰箱中保存，避免反復(fù)凍融。5.75.8引物和TaqMan探針，序列見附錄B。陽性對(duì)照和陰性對(duì)照：陽性對(duì)照使用PRV野毒株細(xì)胞培養(yǎng)物、Bartha-K61疫苗毒，陰性對(duì)照采用滅菌雙蒸水或健康豬的組織材料。5.96除非另有說明，在檢測中所用的試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)室用水應(yīng)符合GB/T6682的要求。樣品采集、處理和運(yùn)輸采樣前準(zhǔn)備6.1參照NY/T541中第5.1條的要求。血液：參照NY/T541中第6.1條中豬血液樣品采集的要求進(jìn)行，將采集的血液注入含1/10體積組織臟器：參照NY/T541中第6.2條和6.3條中的要求進(jìn)行，將采集的病死豬或剖殺豬主要臟器（腦組織、三叉神經(jīng)節(jié)、扁桃體、肺臟、淋巴結(jié)等）或活體采集的扁桃體裝入滅菌的15mL～50mL離心管中，鼻腔拭子：參照NY/T541中第6.4條中的豬鼻腔拭子采集要求進(jìn)行，將拭子樣品放入PBS緩沖液（0.02細(xì)胞培養(yǎng)物：細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，第3次解凍后，4℃4000g離心10min，取上清轉(zhuǎn)入新的無菌無DNA酶的1.5mL離心管中，編號(hào)備用。2DB21/T3273—20206.47樣品運(yùn)輸參照NY/T541中第9條的要求。熒光qPCR操作程序7.1DNA提取在實(shí)驗(yàn)室的核酸提取區(qū)進(jìn)行。7.1.1DNAzol手工提取7.1.1.1取n個(gè)無菌無DNA酶的1.5mL離心管，n為待檢樣品數(shù)+陽性對(duì)照+陰性對(duì)照，對(duì)每個(gè)離心管進(jìn)行編號(hào)。7.1.1.2每管加入800μLDNAzol，分別加入被檢樣品、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照各200μL，顛倒混勻，室溫靜置5min；4℃10000g離心10min。7.1.1.3取900μL上清，轉(zhuǎn)入新的無菌無DNA酶1.5mL離心管中，加入500μL預(yù)冷的無水乙醇，顛倒混勻，室溫放置3min；4℃10000g離心5min。7.1.1.4棄上清，沿管壁緩慢加入1mL-20℃普通冰箱中預(yù)冷的75%乙醇，顛倒混勻，4℃10000g離心5min。重復(fù)洗滌2次后，將離心管倒扣于吸水紙上，自然晾干或用移液器小心移去殘液。7.1.1.57.1.2用50μL8mmol/LNaOH溶液溶解沉淀，DNA在-20℃以下保存?zhèn)溆谩：怂崽崛x提取按照與核酸提取儀匹配的核酸提取試劑盒說明書提取。將提取的DNA轉(zhuǎn)入新的無菌無DNA酶的1.5mL離心管中，在-20℃以下普通冰箱中保存?zhèn)溆?。在試劑配制區(qū)進(jìn)行。gD基因和gE基因的反應(yīng)體系相同。設(shè)熒光qPCR反應(yīng)管數(shù)為n，n為待檢樣品數(shù)+陽性對(duì)照管數(shù)+陰性對(duì)照管數(shù)，每個(gè)反應(yīng)體系見表1，配制體系時(shí)建議按照n+1個(gè)反應(yīng)進(jìn)行配制，配制反應(yīng)體系建議在冰盒中進(jìn)行；配制好的反應(yīng)液充分混勻后，按照每管18μL分裝于PCR反應(yīng)管內(nèi)，并做好標(biāo)識(shí)。3DB21/T3273—2020在核酸提取區(qū)進(jìn)行。每個(gè)反應(yīng)管中按順序分別加入2μL待檢樣品、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照DNA溶液，蓋好蓋子后，PCR微量離心機(jī)瞬時(shí)離心30s，轉(zhuǎn)移至PCR擴(kuò)增區(qū)。7.2.3qPCR擴(kuò)增檢測在PCR擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行。7.2.3.1熒光通道將PCR反應(yīng)管放入熒光PCR儀內(nèi)，設(shè)置探針：5’端選擇FAM熒光通道，3’端選擇無（none）熒光。7.2.3.2熒光qPCR反應(yīng)條件gD和gE基因熒光qPCR反應(yīng)條件均為：94℃3min；94℃15s，60℃45s，收集熒光，40個(gè)循環(huán)。8結(jié)果判定8.1閾值設(shè)定閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴(kuò)增的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。8.2質(zhì)量控制8.2.18.2.28.2.38.3陰性對(duì)照無Ct值，且無典型的S型擴(kuò)增曲線。陽性對(duì)照FAM通道Ct值≤30，且擴(kuò)增曲線為典型的S型。以上要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則，本次實(shí)驗(yàn)無效，需重新進(jìn)行。結(jié)果描述及判定8.3.1gD基因檢測結(jié)果Ct值≤36，且擴(kuò)增曲線為典型的S型，報(bào)告為PRV核酸陽性，但需進(jìn)一步經(jīng)gE基因檢測來進(jìn)行PRV野36＜Ct值≤38，判定為可疑，需從提取DNA開始進(jìn)行一次重復(fù)檢測。如重復(fù)檢測結(jié)果仍為36＜Ct值≤38，且擴(kuò)增曲線均呈典型的S型擴(kuò)增曲線，報(bào)告為PRV核酸陽性，但需進(jìn)一步經(jīng)gE基因檢測來進(jìn)行PRV野毒與疫苗毒的鑒別檢測。4DB21/T3273—20208.3.2.2陽性Ct值≤36，且擴(kuò)增曲線為典型的S型，報(bào)告為PRV野毒核酸陽性。8.3.2.3可疑36＜Ct值≤38，判定為可疑，需從提取DNA開始進(jìn)行一次重復(fù)檢測。如重復(fù)檢測結(jié)果仍為36＜Ct值≤38，且擴(kuò)增曲線均呈典型的S型擴(kuò)增曲線，報(bào)告為PRV野毒核酸陽性。8.3.3鑒別方法針對(duì)缺失包含gE基因在內(nèi)的PRV活疫苗免疫豬只，如果gE基因檢測陽性，則判定為PRV野毒核酸陽性；如果gD基因檢測陽性而gE基因檢測陰性，則判定為PRV疫苗毒陽性；如果gD基因和gE基因檢測均為陰性，則判定為PRV核酸陰性，既無PRV野毒也無疫苗毒。針對(duì)未免疫缺失gE基因的PRV疫苗（△gE/PRV）的豬只，如果gD基因或gE基因檢測結(jié)果為陽性，則判定為PRV野毒核酸陽性；如果gD基因和gE基因檢測均為陰性，則判定為PRV核酸陰性。5DB21/T3273—2020AA附錄A（規(guī)范性附錄）溶液配制A.18mmol/LNaOH溶液的配制稱量0.32gNaOH，溶解到1000mL滅菌去離子水中，混勻，分裝，常溫保存。A.20.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制A.2.10.2mol/L磷酸氫二鈉溶液：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）71.64g，先加適量去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。A.2.20.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：稱取磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）31.21g，先加適量去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。A.2.3量取0.2moL/L磷酸氫二鈉溶液360mL，0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液140mL，稱取氯化鈉38g，用無離子水溶解稀釋至5000mL，4℃保存。6DB21/T3273—2020BB附錄B（規(guī)范性附錄）引物和探針名稱序列（5’-3’）gD-qF（上游引物）gD-qR（下游引物）GTT