DB22-T2078-2014-鹿源結(jié)核桿菌基因分型MLVA法-吉林省

ICS11.220B41DB22吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)DB22/T2078—2014鹿源結(jié)核桿菌基因分型MLVA法MLVAMethodforGenotypingofMycobacteriumTuberculosisfromDeer吉林省技術(shù)質(zhì)量監(jiān)督局發(fā)布DB22/T2078—2014前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國吉林出入境檢驗檢疫局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中華人民共和國吉林出入境檢驗檢疫局、吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)、吉林省中韓動物科學(xué)研究院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王春雨、楊莉、李忠平、石建平、王全凱、孫磊、宋立品、孔德鑫。IDB22/T2078—2014鹿源結(jié)核桿菌基因分型MLVA法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了鹿源結(jié)核桿菌MLVA分型方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于鹿源結(jié)核桿菌MLVA基因分型。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求SN/T2025動物檢疫實驗室生物安全操作規(guī)范3縮略語3.1MLVA:多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析3.2DNAmarker：脫氧核糖核酸分子標(biāo)記3.3SDS:十二烷基硫酸鈉3.5Tris-HCl:三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液3.6EDTA：乙二胺四乙酸多位點數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列分型(multiplelocusVNTRsanalysis，MLVA)以PCR擴增為基礎(chǔ)，利用PCR方法擴增散在于菌株基因組中的不同獨立位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)，對擴增產(chǎn)物進行DNA分析確定長度，根據(jù)不同位點重復(fù)序列單拷貝長度計算出拷貝數(shù)，由不同位點拷貝數(shù)組成菌株基因型。1DB22/T2078—20146.310%SDS：10g的SDS粉末溶解于70ml雙蒸水中，定容到100ml。6.4PCR擴增預(yù)混液6.51MTris-HCl(pH8.0):稱取Tris堿6.06g，加雙蒸水40ml溶解，滴加濃HCl調(diào)pH至8.0，定容至50ml。6.60.5MEDTA(pH8.0):稱取EDTA-Na2·2H2O9.306g，加雙蒸水35ml，攪拌，用NaOH調(diào)pH至8.0，定容至50ml。6.7苯酚/三氯甲烷/異戊醇（體積比25；24；1）6.8三氯甲烷6.9CTAB裂解液：2％CTAB，1.4mol/LNaCl，0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)，0.02mmol/LNa2-EDTA(pH8.0)。6.10CTAB沉淀液：0.5％CTAB，0.04mmol/LNaCl。6.11TE緩沖液:稱取1MTris-HCl(pH8.0)1ml和0.5MEDTA(pH8.0)0.2ml，加加雙蒸水定容至100ml。6.12PCR引物本規(guī)程選擇13個MLVA位點作為擴增位點，各位點引物見表1，引物保存于-20℃，臨用前取出用雙蒸水稀釋為10pmol/μl，置-20℃保存。表1MLVA位點擴增引物引物名稱QUB-11baQUB-11bbMIRU4aMIRU4bMIRU40aMIRU40bMIRU31aMIRU31bMtub4a堿基數(shù)24181919222424192523242423252020182823252424222524AACGCTCAGCTGTCGGATMtub34MIRU22DB22/T2078—2014MIRU2bTACTCGGACGCCGGCTCAAAAT227儀器與設(shè)備7.1生物安全柜7.2梯度PCR儀7.3毛細(xì)管電泳分析系統(tǒng)7.4高速冷凍離心機：最高離心力可達(dá)15000×g以上7.5高壓滅菌器7.6渦漩振蕩器7.7移液器8操作步驟8.1DNA提取8.1.1將結(jié)核桿菌置高壓滅菌器中121℃下15min滅活，取2-3個菌落或50μl菌液放入離心管中，加入200μlTE緩沖液，加10%SDS至終濃度為1%，置85℃～90℃水浴10min。8.1.2加入1.0mLCTAB裂解液及50μL蛋白酶K溶液，渦旋震蕩30s后，顛倒混合5次，65℃水浴過夜（12h-16h）。8.1.3室溫12000r/min離心10min，取上層溶液800μL，加入等體積的Tris飽和酚/三氯甲烷/異戊醇（25:24:1，v/v/v），輕輕顛倒離心管混勻，室溫12000r/min離心10min；取上層清液(水相)于一新離心管中，加入等體積的三氯甲烷/異戊醇（24:1，v/v），顛倒混勻，室溫12000r/min離心10min，取上清液600μL，加入2倍體積的CTAB沉淀液，混勻，室溫靜置60min。12000r/min離心15min，棄上清液。加入500μL氯化鈉溶液溶解沉淀，然后加入500μL三氯甲烷，振蕩混勻，12000r/min離心10min，將上清液移至一新離心管，加入0.6倍體積的異丙醇，混勻，4℃靜置30min，4℃，12000r/min離心10min，小心棄去上清液，向沉淀加入500μL70%冷乙醇，洗滌沉淀，4℃，12000r/min離心5min，小心倒出上清液，室溫干燥后，將DNA溶于50μL去離子水中，-20℃保存。也可使用等效的商品化試劑盒提取模板DNA。取5μLDNA溶液加二次蒸餾水稀釋至1mL，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計分別檢測260nm和280nm處的吸光值A(chǔ)260和A280。DNA的濃度按式（1）計算：.................................(1)式中：3DB22/T2078—2014PCR反應(yīng)體系確定為：DNA0.5μl、上下游引物(10pmol/L)各0.2μl、PCR擴增預(yù)混液10μl、雙蒸水9.1μl。8.4PCR擴增不同位點PCR擴增條件詳見表2。表2不同MLVA位點PCR擴增反應(yīng)條件位點反應(yīng)條件第二步循環(huán)數(shù)MIRU4MIRU23第一步95℃15min第二步94℃1min，59℃1min40MIRU31MIRU39MIRU40MIRU272℃1min30s第三步72℃10minETRAQUB-11bQUB-26第一步95℃12min第二步94℃30s60℃1min404072℃2min第三步72℃7minMtub34Mtub30Mtub21Mtub4第一步95℃15min第二步94℃1min50℃1min以50bpDNAmarker為標(biāo)準(zhǔn)，各位點的PCR產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳檢測，確定PCR產(chǎn)物片段大小，毛細(xì)管電泳條件如下：加樣體積：5μl；電壓：100～240V，50/60Hz；工作溫度：10℃～30℃；工作濕度：10%～75%；用毛細(xì)管電泳檢測的PCR產(chǎn)物長度減去對應(yīng)上下游引物的長度，再除以對應(yīng)位點的單拷貝片段長度，所得結(jié)果即為重復(fù)區(qū)序列的拷貝數(shù)。各重復(fù)區(qū)單拷貝片段長度大小見表3。表3MLVA各位點重復(fù)序列單拷貝長度位點單拷貝長度單拷貝長度MIRU4MIRU31MIRU39MIRU40MIRU234DB22/T2078—2014MIRU2ETRA5375QUB-261119結(jié)果分析將PCR產(chǎn)物長度換算為重復(fù)序列拷貝