高三一輪復(fù)習(xí)生物：基因工程PCR專題課件

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PCR專題匯報人：WPS重難點PCR技術(shù)的基本原理PCR技術(shù)的結(jié)果分析及計算PCR技術(shù)中引物的選擇PCR的基本過程PCR技術(shù)的基本原理重難點一一、PCR技術(shù)的基本原理1.在體外(PCR擴增儀)提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。①全稱：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)②原理：DNA半保留復(fù)制的原理③前提：一段已知目的基因的核苷酸序列。④條件：模板DNA

一對引物（兩種）

熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶)4種游離的脫氧核苷酸[dNTP](包括：dATP、dTTP、

dCTP、dGTP；作用：提供原料和能量)⑤前提：已知目的基因的一段核苷酸序列，以便根據(jù)這段序列合

成引物。PCR擴增儀一、PCR技術(shù)的基本原理2.PCR技術(shù)所需要的條件及作用條件作用緩沖液PCR反應(yīng)緩沖液中一般要添加

Mg2+以激活DNA聚合酶DNA母鏈提供復(fù)制模板（目的基因做母鏈）兩種引物使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸游離的4種脫氧核苷酸提供復(fù)制的原料耐高溫的DNA聚合酶催化合成DNA子鏈(形成磷酸二酯鍵)PCR的基本過程重難點二二、PCR的基本過程當(dāng)溫度超過90℃時，雙鏈DNA解聚為單鏈。變

性復(fù)

性延

伸變

性90℃二、PCR的基本過程當(dāng)溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。變

性復(fù)性延

伸50℃二、PCR的基本過程變

性復(fù)

性延伸當(dāng)溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)的產(chǎn)物。第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪循環(huán)的產(chǎn)物。72℃二、PCR的基本過程PCR技術(shù)中引物的選擇重難點三三、PCR技術(shù)中引物的選擇思考并回答下列有關(guān)引物的問題。(1)引物的本質(zhì)是什么？引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸，既可以是DNA單鏈，也可以是RNA單鏈。細(xì)胞內(nèi)的DNA進(jìn)行復(fù)制時，也需要引物，一般是RNA片段。(2)用于PCR的引物的長度通常為多少個核苷酸？用于PCR的引物長度通常為20～30個核苷酸。三、PCR技術(shù)中引物的選擇思考并回答下列有關(guān)引物的問題。(3)細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制時是否需要引物？為什么？需要。因為DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA單鏈，只能將游離的脫氧核苷酸連接在一條DNA單鏈的3′端，所以在延伸子鏈前，需要提前合成一小段RNA或DNA作為引物。(4)利用PCR擴增目的基因時，為什么要用2種不同的引物？DNA是兩條反向平行的雙鏈結(jié)構(gòu)，而復(fù)制時只能從固定的方向(模板鏈的3′端)開始，所以引物的堿基序列是不同的。思考并回答下列有關(guān)引物的問題。(5)如果已知某目的基因的序列和結(jié)構(gòu)，利用PCR篩選和擴增出該目的基因的關(guān)鍵是什么？根據(jù)目的基因兩端的核苷酸序列設(shè)計引物。(6)設(shè)計引物需要注意的問題是什么？三、PCR技術(shù)中引物的選擇引物自身不能有互補的序列兩種引物之間不能有互補的序列引物不能太短，避免特異性不強。引物短可與模板鏈多處進(jìn)行堿基互補配對5’-ACGATTAC······TCCGGATAA-3’（α鏈）3’-TGCTAATG······AGGCCTATT-5’（β鏈）三、PCR技術(shù)中引物的選擇←引物擴增的方向引物擴增的方向→3’-ATT-5’（引物2）（引物1）5’-ACG-3’引物與待擴增序列（目的基因）的對應(yīng)關(guān)系如下：引物1與待擴增基因中部分序列(α鏈)相同。在此情況下，引物1結(jié)合

的是β鏈，向著和α鏈相同的方向擴增，即“同向相同，同向擴增”。0引物2與待擴增基因中部分序列(α鏈)反向互補。這種情況下，引物2與α鏈結(jié)合，并向著和α鏈相反的方

向擴增，即“反向互補，反向擴增”三、PCR技術(shù)中引物的選擇解題突破點1引物應(yīng)位于目的基因兩側(cè)，且能順利擴增出目的基因2引物只能與母鏈的3'端結(jié)合。引物只能引導(dǎo)子鏈從5'端向3'端延伸

3為了便于擴增的DNA片段與表達(dá)載體連接，可在引物的5'端加上限制酶的識別序列，且常在兩種引物上設(shè)計不同的酶切位點，保證目的基因與載體的正向連接三、PCR技術(shù)中引物的選擇試一試：

反向PCR技術(shù)擴增1.[2025江西宜春模擬](多選)常規(guī)PCR只能擴增兩引物間的DNA區(qū)段，要擴增已知DNA序列兩側(cè)的未知DNA序列，可用反向PCR技術(shù)。反向PCR技術(shù)擴增的原理如圖所示。下列敘述正確的是（

）三、PCR技術(shù)中引物的選擇A.切割M和N時選用的限制酶可以相同，也可以不同B.環(huán)化之后產(chǎn)生的DNA分子沒有游離的磷酸基團(tuán)C擴增時，應(yīng)選擇圖中引物1和引物4，且二者間不能互補配對D.PCR儀設(shè)置溫度時，一個循環(huán)一次是高溫變性、中溫復(fù)性、低溫延伸答案：ABC解析：由酶切片段推出環(huán)狀DNA的5’端和引物的5’端與3’端5’5’3’5’3’5’5’3’5’3’突破點1、2：PCR過程中需要兩種引物，引物引導(dǎo)子鏈從5’端向3’端延伸，為保證擴增的是已知序列兩側(cè)的未知序列，故應(yīng)該選擇引物1與引物4，且二者間不能互補配對。C正確。切割M和N時選用的限制酶要保證產(chǎn)生相同的黏性末端，可以選相同的限制酶，也可以選不同的限制酶，A正確。環(huán)狀DNA分子沒有游離的磷酸基團(tuán)，B正確。PCR技術(shù)的操作步驟依次是高溫使DNA變性、低溫復(fù)性(使DNA單鏈與引物結(jié)合)、中溫延伸，D錯誤。三、PCR技術(shù)中引物的選擇新角度：設(shè)計引物時應(yīng)滿足什么條件科研人員將高產(chǎn)基因和抗除草劑草甘膦基因作為目的基因，利用重疊延

伸PCR技術(shù)構(gòu)建融合基因，從而培育出既高產(chǎn)又抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因大豆。融合基因構(gòu)建

過程如圖1所示，所用Ti質(zhì)粒及限制酶切割位點如圖2所示。回答下列問題：三、PCR技術(shù)中引物的選擇(1)圖1中，兩條雜交鏈的獲得都至少需要經(jīng)過

次擴增循環(huán)。PCR1與PCR2的產(chǎn)

物能夠形成雜交鏈的條件是

。PCR3過程不需要引物，其原因是

三、PCR技術(shù)中引物的選擇(2)若要將獲得的融合基因用于構(gòu)建基因表達(dá)載體，應(yīng)選用引物

對融合基因進(jìn)行PCR擴增，為了保證擴增后的融合基因能正向插人Ti質(zhì)粒中，在設(shè)計這兩種引物時應(yīng)滿足的條件是.三、PCR技術(shù)中引物的選擇(3)將融合基因?qū)朕r(nóng)桿菌需用Ca2+先處理農(nóng)桿菌，目的是

.利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將融合基因?qū)朕r(nóng)桿菌、大豆細(xì)胞的過程中，需要篩選兩次，這兩次

篩選分別是.2.

(1)突破點2：圖1中，目的基因經(jīng)過一次循環(huán)可得到含有引物P2或引物P3的單鏈，但引物P2端和引物P3端都為相應(yīng)鏈的5'端，不可直接延伸子鏈。為了使雜交鏈順利延伸子鏈，至少需要經(jīng)過2次循環(huán)才能得到如圖1所示的引物P2端和引物P3端都為相

應(yīng)鏈的3'端的雜交鏈。為實現(xiàn)PCR1的產(chǎn)物能與PCR2的產(chǎn)物融合，設(shè)計引物時應(yīng)該考慮引物

P2的5'端與引物P3的5'端的一小段DNA序列互補配對。據(jù)圖1可知，兩條雜交鏈3'端的堿基序列可以作為子鏈合成的引物，因此PCR3過程中不需要引物。(2)據(jù)圖1分析，擴增獲得的融合基因，需要引物P1和P4。突破點3：構(gòu)建基因表達(dá)載體時，融合基因應(yīng)插入Ti質(zhì)粒的啟動子和終止子之間，因此需用限制酶NheI、XmaI切割質(zhì)粒。要保證融合基因能夠正向插入Ti質(zhì)粒中，融合基因在擴增后能夠被限制酶NheI、XmaI切割，且插入的融合基因的轉(zhuǎn)錄方向應(yīng)與質(zhì)粒上啟動子的方向一致，因此需在引物P1的5'端加上限制酶Nhe

I的識別序列，在引物P4的5'端加上限制酶XmaI的識別序列。

(3)用Ca2+先處理農(nóng)桿菌，其目的是使農(nóng)桿菌能夠吸收周圍環(huán)境中的DNA分子。兩次篩選情況分析如表：

第一次是篩選出含重

組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌構(gòu)建基因表達(dá)載體時，重組質(zhì)粒中卡那霉素抗性基因被破壞，潮霉素

抗性基因完整，因此需篩選出能在含潮霉素培養(yǎng)基上生長而不能在

含卡那霉素培養(yǎng)基上生長的農(nóng)桿菌

第二次是篩選出導(dǎo)入

目的基因的大豆細(xì)胞用該農(nóng)桿菌去感染大豆細(xì)胞，由于融合基因中含有草甘膦抗性基因，

因此在添加草甘膦的培養(yǎng)基中能夠生長的大豆細(xì)胞為導(dǎo)入融合基因

的細(xì)胞參考答案：(1)2引物P2和引物P3的5'端存在部分堿基互補配對的序列

兩條雜交鏈3'端

的堿基序列可以作為子鏈合成的引物(2)P1和P4在引物P1的5'端加上限制酶Nhe

I的識別序列，在引物P4的5'端加上限制酶XmaI的識別序列(3)使其能夠吸收周圍環(huán)境中的

DNA先篩選出能在含潮霉素培養(yǎng)基上生長而不能在含卡那霉素培養(yǎng)基上生長的農(nóng)桿菌，再

用含草甘膦的培養(yǎng)基篩選出導(dǎo)入融合基因的大豆細(xì)胞(合理即可)PCR技術(shù)的結(jié)果分析及計算重難點四四、PCR技術(shù)的結(jié)果分析及計算1.PCR技術(shù)的示意圖(1)第二次循環(huán)結(jié)束后,體系中有3種長度不等的DNA單鏈(a、b、c)。①a表示原DNA的單鏈,共2條。②b是以a為模板合成的子鏈。③c表示以b為模板合成的子鏈。(2)第三次循環(huán)后,體系中(a+b)DNA有2個,(b+c)DNA有4個,(c+c)DNA(兩條鏈等長的DNA)有2個。PCR的結(jié)果分析2.PCR中的數(shù)量關(guān)系匯總復(fù)制次數(shù)123nDNA分子數(shù)2482n含引物的DNA分子數(shù)2482n共消耗引物的對數(shù)1=21-13=22-17=23-12n-1含某種特定引物的DNA分子數(shù)1=21-13=22-17=23-12n-1同時含兩種引物的DNA分子數(shù)0=21-22=22-26=23-22n-2脫氧核苷酸鏈等長的DNA分子數(shù)0=21-20=22-42=23-62n-2n(1)每一條子鏈都以引物為起點進(jìn)行延伸,故新合成的子鏈數(shù)=消耗的引物數(shù)。(2)PCR體系需要兩種引物,且兩種引物同時使用,故消耗某種特定引物的數(shù)量=消耗的引物數(shù)/2。試一試下圖為利用反轉(zhuǎn)錄方法和PCR技術(shù)擴增目的基因片段的過程示意圖。據(jù)圖分析,下列說法錯誤的是

(

)

A.在第3輪循環(huán)結(jié)束后,兩條鏈等長的DNA占1/4B.⑤過程使用70~75℃的溫度處理既可以防止DN