綠色熒光蛋白

普通生物學實驗

GFP報告基因的顯微觀察及其在生物學研究中的應(yīng)用報告基因－reportergene編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因,其表達產(chǎn)物容易被鑒定；將它的編碼序列和目的基因的表達調(diào)控序列或目的基因相融合，轉(zhuǎn)化到生物體中；通過檢測其表達可以研究在生物體內(nèi)，調(diào)控序列的作用方式或目的基因的表達調(diào)控。報告基因的特點已被克隆和全序列已測定；表達產(chǎn)物在受體細胞中不存在，即無背景，在被轉(zhuǎn)染的細胞中無相似的內(nèi)源性表達產(chǎn)物；其表達產(chǎn)物容易觀察或能進行定量測定常用的報告基因基因名稱基因編碼蛋白檢測方法GUSβ-D-glucuronidase（β-D-葡萄糖苷酶）催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物體中幾乎無背景，組織化學檢測很穩(wěn)定Luciferase熒光素酶在有ATP、Mg2＋、O2和熒光素（luciferin）存在下發(fā)出熒光(化學發(fā)光，chemiluminescent）GFP綠色熒光蛋白藍色激發(fā)光下發(fā)出綠色熒光1:GUS報告基因廣泛用于植物、細菌和動物的基因表達研究β-D-glucuronidase（β-D-葡萄糖苷酶）催化底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸(X-Gluc)形成藍色產(chǎn)物。檢測方法：組織化學法（最常用）、分光光度法（最靈敏）、熒光法植物莖尖生長點WUS、CLV3、RAX1、LAS、MYB2等基因的表達2:LuciferaseLuciferase在底物存在的條件下高度不穩(wěn)定，因此適合于動態(tài)調(diào)控的研究；用生物鐘調(diào)控的啟動子驅(qū)動Luciferase的表達；通過該轉(zhuǎn)基因植物研究植物的生物周期節(jié)律的調(diào)控，分離突變體；這一系統(tǒng)的優(yōu)勢在于高通量、非破壞性、自動監(jiān)測3:綠色熒光蛋白--GFPGFP最初從水母，jellyfishAequoreavictoria

中分離出在分子生物學和細胞學領(lǐng)域，GFP是廣泛使用的報告基因

GFPGFP蛋白含238氨基酸殘基，分子量29.6KDaFluorescentprotein(熒光蛋白):

在藍-紫外光的激發(fā)下產(chǎn)生強的綠色熒光2008諾貝爾獎得主：OsamuShimomura：發(fā)現(xiàn)GFP；RogerChalfie:將GFP用作報告基因；RogerTsien：揭示GFP產(chǎn)生熒光的機制，研發(fā)出一系列GFP的衍生物。GFP基因的主要應(yīng)用研究基因表達調(diào)控序列（組織特異性表達，調(diào)控序列的確定）蛋白質(zhì)的細胞內(nèi)定位、運動蛋白質(zhì)相互作用（splitLuciferase/GFP）、降解等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究組織特異性表達蛋白相互作用_SplitGFP蛋白質(zhì)的細胞內(nèi)定位蛋白質(zhì)的亞細胞定位

DR5:GFPTGTCTCGUS(orGFP)DR5報告基因主要用于檢測植物體內(nèi)生長素反應(yīng)水平DR5

由7個生長素應(yīng)答元件（auxin-responseelement，AuxRE)組成。該元件是生長素應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子（auxin-responsivetranscriptionfactors，ARFs)的結(jié)合位點。AuxREGFP基因在生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中的運用DR5:GFP重力方向?qū)嶒灢牧希篋R5-GFP轉(zhuǎn)基因植株

實驗?zāi)康模豪肎FP研究植物體內(nèi)生長素的信號調(diào)控生長素調(diào)控DR5－GFP在根部的表達觀測實驗試劑：吲哚乙酸（IAA，生長素）1μMIAAPropidiumiodide,PI,碘化丙啶

1x工作液:10μg/mlPIinPBS或水實驗儀器：熒光顯微鏡實驗步驟：取部分轉(zhuǎn)基因幼苗放入IAA溶液中處理5-10分鐘。無IAA處理的作為對照。PI染色將植物根部浸泡在1XPI工作液中10秒左右。用水沖洗30秒。4.制片用擦鏡紙擦載玻片滴一滴水用鑷子取一棵幼苗，將根部在水中展開（可以將葉片切除）用鑷子夾取蓋玻片，從一側(cè)輕輕蓋上5.顯微鏡觀察放下載物臺，將載玻片放上載物臺，旋轉(zhuǎn)20X物鏡至光路，濾光片在明場位置（1）將載物臺上升至離物鏡很近處，不要碰到物鏡尋找視野中模糊的根，下調(diào)載物臺，聚焦移動載物臺，尋找根尖轉(zhuǎn)換至40X物鏡，濾光片調(diào)至藍光（3）或綠光（4），打開s