DB22-T2987-2019-抗蟲玉米Bt蛋白表達(dá)量檢測技術(shù)規(guī)范-吉林省

ICS65.020.20DB22B05吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)DB22/T2987—2019抗蟲玉米Bt蛋白表達(dá)量檢測技術(shù)規(guī)范TechnicalspecificationforquantitativedetectionofBtproteinsininsectresistancemaize吉林省市場監(jiān)督管理廳發(fā)布DB22/T2987—2019前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由吉林省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：龍麗坤、夏蔚、李蔥蔥、劉娜、閆偉、董立明、邢珍娟、謝彥博、李飛武。IDB22/T2987—2019抗蟲玉米Bt蛋白表達(dá)量檢測技術(shù)規(guī)范1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了抗蟲玉米Bt蛋白表達(dá)量檢測的總體要求、試驗(yàn)材料、試劑和材料、儀器設(shè)備、樣品、檢測程序、結(jié)果判定與表述。本標(biāo)準(zhǔn)適用于轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米環(huán)境安全評價(jià)中檢測外源Bt蛋白含量ELISA技術(shù)的實(shí)施和運(yùn)用。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4404.1-2008糧食作物種子第1部分：禾谷類GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T19495.1轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測通用要求和定義GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求GB/T19495.8轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測蛋白質(zhì)檢測方法農(nóng)業(yè)部953號公告-10.1-2007轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品環(huán)境安全檢測抗蟲玉米第1部分：抗蟲性轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抽樣樣品中被穩(wěn)定檢出的最低蛋白含量或濃度。定量限limitofquantification樣品中被定量檢出的最低蛋白含量或濃度。變異系數(shù)coefficientofvariation1DB22/T2987—20194.1檢測人員應(yīng)具備轉(zhuǎn)基因生物安全管理和檢測的相關(guān)知識，并在開展取樣和檢測工作前，接受相關(guān)技術(shù)和業(yè)務(wù)知識培訓(xùn)。4.2檢測實(shí)驗(yàn)室應(yīng)符合GB/T19495.2規(guī)定的要求。4.3檢測過程應(yīng)符合GB/T19495.1規(guī)定的要求。5試驗(yàn)材料5.1受檢材料為種植的待檢測的玉米材料及受體對照材料。5.2種子質(zhì)量應(yīng)達(dá)到GB4404.1-2008中二級以上玉米種子要求。5.3種植和管理參照農(nóng)業(yè)部953號公告-10.1-2007的要求。6試劑和材料6.1除非另有說明，僅使用分析純試劑和重蒸餾水或符合GB/T6682規(guī)定的二級水。6.2根據(jù)待檢Bt蛋白的類型，選用對應(yīng)的ELISA試劑盒，于保質(zhì)期內(nèi)驗(yàn)證試劑盒體系，并在有效期內(nèi)使用。試劑盒的定量限（LOQ）應(yīng)不大于0.1μg/L或0.1ng/g。6.3蛋白提取緩沖液可使用ELISA試劑盒中提供的，或根據(jù)需要可選擇效果相當(dāng)?shù)奶崛【彌_液。7儀器設(shè)備7.1分析天平，感量0.01g。8.1.1隨機(jī)取樣,每小區(qū)取樣株數(shù)應(yīng)不少于10株，同時(shí)采集同批待檢測的玉米材料及受體對照材料，具體抽樣數(shù)量和方法按照農(nóng)業(yè)部2031號公告-19-2013規(guī)定執(zhí)行。8.2.1每個(gè)小區(qū)采集的樣品分別在液氮中快速研磨成粉末，稱取不少于0.5g。8.2.2按照ELISA檢測試劑盒步驟，按一定的質(zhì)量體積比加入蛋白提取緩沖液，制備樣品蛋白溶液。9檢測程序2DB22/T2987—20199.1.2包括標(biāo)準(zhǔn)蛋白在內(nèi)，每個(gè)測試樣品不少于3個(gè)平行。9.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作9.2.1用蛋白提取緩沖液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)蛋白的稀釋，不少于6個(gè)濃度梯度。9.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R≥0.98。29.3試樣檢測9.3.1根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品確定檢測范圍，以蛋白提取緩沖液將樣品溶液稀釋到合適的分析濃度。9.3.2按照選定的ELISA試劑盒操作說明操作。9.3.3使用酶標(biāo)儀測定相應(yīng)波長下的光密度值（Opticaldensity，OD），并讀取樣品試液中Bt蛋白的濃度值。9.4主要參數(shù)要求9.4.1應(yīng)以變異系數(shù)（CV）分析標(biāo)準(zhǔn)蛋白和陽性樣品的平行間差異。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)同一樣品平行間光密度值差異不得超過15%，所得濃度差異不得超過20%。如果超過CV百分?jǐn)?shù)上限，須重新檢測。9.4.2應(yīng)確定方法定量限（LOQ）和檢出限（LOD）。注：可采用標(biāo)準(zhǔn)曲線中線性范圍內(nèi)最低標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為方法LOQ?？刹捎脴?biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白繼續(xù)稀釋的方法確定LOD，為光密度檢測能達(dá)到不低于陰性對照OD值2.1倍的最低標(biāo)準(zhǔn)品濃度值，或選用其他有效確定方法。9.5結(jié)果計(jì)算大于或等于LOQ的樣品試液濃度值，應(yīng)按式（1）計(jì)算待測樣品中的Bt蛋白含量。Y×Nω=X×1000......................................(1)ω——待測樣品中的Bt蛋白含量，單位為微克每克鮮重（μg/g鮮重）；Y——試液中的蛋白濃度，單位微克每升（μg/L）；N——樣品溶液的稀釋倍數(shù)；X——樣品溶液的質(zhì)量體積比，單位克每毫升（g/mL）。注：計(jì)算結(jié)果保留兩位小數(shù)?！獞?yīng)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算各小區(qū)樣品的外源Bt蛋白含量平均值（ω）和標(biāo)準(zhǔn)差（S），外源Bt蛋白含3DB22/T2987—2019表1結(jié)果判定和表述樣品試液測定值結(jié)果判定與表述—樣品